[發(fā)明專利]用于基因組DNA片段的靶向純化的制備型電泳方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680067508.0
• 申請日: 2016-11-21
• 公開（公告）號(hào): CN108699101B
• 公開（公告）日: 2022-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: R·D·米特拉;J·米爾布蘭德特;E·S·阿伯拉姆斯;T·J·巴伯拉;T·C·伯勒斯
• 申請（專利權(quán)）人: 塞奇科學(xué)股份有限公司;華盛頓大學(xué)
• 主分類號(hào): C07H21/02
• 分類號(hào): C07H21/02;C12N15/09;C12N15/10
• 代理公司: 中國貿(mào)促會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 11038
• 代理人: 李程達(dá)

包含具有高分子量(HMW)DNA的顆粒的樣品被截留在凝膠基質(zhì)中，并且凝膠基質(zhì)暴露于配置為從顆粒釋放HMW DNA的裂解試劑。HMW DNA可以通過以下而被純化：使凝膠基質(zhì)經(jīng)受從凝膠基質(zhì)中除去來自顆粒的HMW DNA、裂解試劑和/或其他樣品成分的電泳場，使得HMW DNA保留。凝膠基質(zhì)可以經(jīng)受DNA裂解酶試劑，該裂解酶被配置為在HMW DNA內(nèi)的特定DNA序列處進(jìn)行裂解以釋放DNA的確定的區(qū)段作為尺寸減小的片段。凝膠基質(zhì)也可以經(jīng)受電泳場，其移動(dòng)并分離來自HMW DNA的未裂解的DNA的DNA片段，所述未裂解的DNA基本保持不動(dòng)。電泳分離的DNA片段可以從凝膠基質(zhì)中分離。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2015年11月20日提交的標(biāo)題為“PREPARATIVE ELECTROPHORETICMETHOD FOR TARGETED PURIFICATION OF GENOMIC DNA FRAGMENTS”的美國臨時(shí)專利申請NO.62/258,384的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文中。

介紹

由于全基因組測序的高成本和全基因組序列分析的復(fù)雜性，大多數(shù)下一代測序?qū)嶒?yàn)試圖檢查基因組的靶向區(qū)域，例如所有蛋白質(zhì)編碼區(qū)(整個(gè)外顯子組測序，“WES”)或所謂的靶向測序研究中的特定基因子集(或基因組區(qū)域的特定子集)。當(dāng)使用條形碼化的測序適配器進(jìn)行這樣的靶向測序?qū)嶒?yàn)時(shí)，許多這樣的樣品可以合并并且在單次測序運(yùn)行中一起運(yùn)行，由此顯著降低每個(gè)樣品測序成本。基于這個(gè)原因，今天(以及過去幾年)進(jìn)行的絕大多數(shù)NGS都是WES或靶向測序。

用于制備靶向測序文庫的最常用方法分為兩種通用策略1)雜交捕獲，或2)擴(kuò)增子文庫構(gòu)建。

在雜交捕獲方法中，靶向基因組DNA片段變性為單鏈形式并在溶液中與生物素標(biāo)記的單鏈核酸探針(也稱為“誘餌”)雜交。雜交后，將生物素標(biāo)記的雜交物捕獲到抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素涂覆的微粒(通常順磁性顆粒)上，然后通過磁性或離心收集顆粒與溶液相非靶向基因組DNA分離。

文庫構(gòu)建可以在靶序列捕獲之前或之后進(jìn)行。在最常用的技術(shù)形式(如AgilentSureselect和Illumina全外顯子試劑盒)中，在雜交捕獲之前進(jìn)行DNA片段化，末端修復(fù)和測序適配器連接。然而，在一些靶向測序方案中，雜交捕獲先于文庫構(gòu)建(Wang等，BMCGenomics，(2015)16:214；DOI 10.1186/s12864-015-1370-2)。

雜交探針可以是單鏈DNA，RNA或其類似物。許多人發(fā)現(xiàn)將捕獲探針設(shè)計(jì)為含有強(qiáng)RNA聚合酶啟動(dòng)子(如T7RNA聚合酶啟動(dòng)子)的DNA寡核苷酸是方便的，從而可以通過體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)廉價(jià)地生產(chǎn)生物素化的單鏈RNA捕獲探針。當(dāng)需要在大量樣品中檢測相同的靶向組時(shí)，這樣的方法特別有用(Gnirke等，Nature Biotechnology，(2009)27：182)。

在擴(kuò)增子文庫法中，首先通過PCR擴(kuò)增用于測序的目標(biāo)區(qū)域，然后將PCR產(chǎn)物用作NGS文庫構(gòu)建的DNA輸入。這種方法最流行的例子是Life Technologies公司的AmpliSeq靶向測序試劑盒(舉例而言)。擴(kuò)增子測序方法在臨床實(shí)驗(yàn)室中很受歡迎，因?yàn)镻CR允許使用較小的輸入樣本量(1-10ng輸入DNA)。

靶向測序的兩種方法都具有共同的缺點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冃枰鄬Υ罅康暮怂嵩噭弘s交捕獲方法中的生物素化探針，或擴(kuò)增子測序情況下的PCR引物對。當(dāng)使用普通的短讀測序(short-read sequencing)技術(shù)如Illumina或Ion Torrent(典型的原始閱讀長度400bp)來檢查基因組DNA的長的幾千堿基(kb)區(qū)域時(shí)，這尤其值得關(guān)注。一個(gè)相關(guān)的問題是，在便利的多重形式中設(shè)計(jì)和優(yōu)化試劑盒的復(fù)雜性，所述試劑盒使用具有所需特異性/嚴(yán)格性的復(fù)雜探針或引物組。