[發明專利]用于從液體培養基失活和提取耐酸細菌以用于使用質譜法表征和/或鑒定的方法

在審

• 申請號: 201680060904.0
• 申請日: 2016-07-15
• 公開（公告）號: CN108291247A
• 公開（公告）日: 2018-07-17
• 發明（設計）人: 帕拉姆帕爾·多爾;埃里克·米勒;埃里克·莫雷諾;希瑟·托蒂
• 申請（專利權）人: 生物梅里埃有限公司
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24;C12M1/00;C12N1/02
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 王瑋瑋;鄭霞

1.一種用于失活和提取測試樣品中耐酸細菌的方法，所述方法包括以下順序步驟：

(a)將來自包含耐酸細菌的液體培養物的測試樣品轉移至第一管中，其中所述第一管包括主體、具有開口的主體第一末端、和具有以凹形尖端終止的截頭圓錐體部分的主體第二末端；

(b)離心所述第一管以使所述耐酸細菌沉淀于所述凹形尖端中并且隨后傾析第一上清液，其中以所述凹形尖端終止的所述截頭圓錐體部分被配置為將所述耐酸細菌的沉淀物保留在所述凹形尖端中同時傾析至少90％的所述第一上清液；

(c)將所述耐酸細菌沉淀物重懸于醇中以產生懸浮液；

(d)將所述懸浮液從所述第一管轉移至包含珠的第二管中；

(e)任選地攪動所述第二管以破碎團塊和/或破壞耐酸細菌細胞；以及

(f)任選地孵育所述懸浮液，優選地持續至少約5分鐘，以使所述測試樣品中的所述耐酸細菌失活。

2.如權利要求1所述的方法，所述方法還包括以下步驟：

(g)將所述懸浮液轉移至第三管中并且離心所述第三管以使所失活的耐酸細菌沉淀，并且隨后去除第二上清液。

3.如權利要求2所述的方法，所述方法還包括以下步驟：

(h)重懸所述失活的耐酸細菌沉淀物以產生包含所述失活的耐酸細菌的溶液；

(i)從包含失活的耐酸細菌的溶液中提取細胞蛋白，并且離心所述溶液以使細胞碎片沉淀；

(j)將來自步驟(i)的第三上清液的等分試樣轉移至質譜法靶載玻片；以及

(k)使用質譜儀在質譜法載玻片上鑒定所述失活的耐酸細菌的蛋白譜。

4.如權利要求3中所述的方法，其中步驟(h)中的所述沉淀物被重懸于甲酸中。

5.如權利要求4中所述的方法，其中將乙腈添加至所重懸的失活的耐酸細菌中至從約35％至約65％的最終濃度。

6.如權利要求3-5中任一項所述的方法，其中所述耐酸細菌樣品被鑒定為科、屬、種、菌株水平和/或群/復合種群。

7.如權利要求3-6中任一項所述的方法，所述方法還包括通過質譜法詢問所述載玻片上的所述測試樣品以獲得所述耐酸細菌的一個或更多個質譜并且通過將所測量的一個或更多個質譜與一個或更多個參考質譜進行比較來表征和/或鑒定所述測試樣品中的所述耐酸細菌。

8.如權利要求7所述的方法，其中所述樣品來自液體培養基并且其中：

步驟(a)中的測試樣品是液體培養基；

任選地不存在攪動所述第二管以破碎團塊和/或破壞耐酸細菌細胞的步驟(e)；

步驟(f)是需要的并且包括在醇中孵育所述懸浮液。

9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述主體具有約5mL的體積。

10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述第一上清液的至少約99％在步驟(b)中被去除。

11.如權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述耐酸細菌是分枝桿菌屬(Mycobacterium)或諾卡氏菌屬(Nocardia)。

12.如權利要求1-11中任一項中所述的方法，其中所述醇是乙醇。

13.如權利要求1-12中任一項中所述的方法，其中步驟(e)是需要的并且包括使用珠磨器或渦旋器和珠攪動所述第二管，其中所述珠是0.5mm玻璃珠。

14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述方法還包括在步驟(f)中在室溫孵育所述懸浮液持續至少約10分鐘。