[發(fā)明專利]用于通過同源重組的基于CRISPR/CAS的基因組編輯的化合物和方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680049767.0
• 申請(qǐng)日: 2016-08-30
• 公開（公告）號(hào): CN107922949A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: A·肯尼迪;G·塞納;S·羅伊;C·W·榮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安捷倫科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/63;C12N9/22
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所11494
• 代理人: 封新琴

1.一種合成的引導(dǎo)RNA，其包含：

crRNA區(qū)段，其包含(i)能夠與靶序列雜交的引導(dǎo)序列，(ii)莖序列；

tracrRNA區(qū)段，其包含與所述莖序列部分或完全互補(bǔ)的核苷酸序列；和

第一銜接子區(qū)段，其包含與(i)供體多核苷酸、(ii)第二銜接子區(qū)段、或(iii)夾板區(qū)段互補(bǔ)的序列，

其中所述銜接子序列包含一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾；并且

其中所述合成的引導(dǎo)RNA具有g(shù)RNA功能性。

2.權(quán)利要求1的合成的引導(dǎo)RNA，其中至少一個(gè)所述的修飾是增加所述銜接子序列對(duì)RNA酶H切割的抗性的修飾。

3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的合成的引導(dǎo)RNA，其中銜接子區(qū)段中的修飾包含2'-O-甲基模塊、2'-氟模塊、2'-脫氧模塊、硫代磷酸酯核苷酸間鍵、膦酰基乙酸核苷酸間鍵合、硫代膦酰基乙酸核苷酸間鍵或其組合。

4.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的合成的引導(dǎo)RNA，其中所述銜接子區(qū)段包含選自下組的一個(gè)或多個(gè)修飾：具有3'-硫代磷酸酯基團(tuán)的2'-O-甲基核苷酸、具有3'-膦酰基羧酸基團(tuán)的2'-O-甲基核苷酸、具有3'-膦?；宜峄鶊F(tuán)的2'-O-甲基核苷酸、具有3'-硫代膦酰基羧酸基團(tuán)的2'-O-甲基核苷酸、具有3'-硫代膦酰基乙酸基團(tuán)的2'-O-甲基核苷酸、具有3'-膦?；宜峄鶊F(tuán)的2'-脫氧核苷酸和具有3'-硫代膦?；宜峄鶊F(tuán)的2'-脫氧核苷酸。

5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的合成的引導(dǎo)RNA，其中所述銜接子區(qū)段連接至tracrRNA區(qū)段，并且所述增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾之一位于所述銜接子區(qū)段的最后五個(gè)核苷酸內(nèi)。

6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的合成的引導(dǎo)RNA，其中所述第一銜接子區(qū)段是RNA序列。

7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的合成的引導(dǎo)RNA，其中所述第二銜接子區(qū)段是DNA序列。

8.一種引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物，其包含(a)具有g(shù)RNA功能性的合成的引導(dǎo)RNA和(b)供體多核苷酸，

其中所述合成的引導(dǎo)RNA包含：

crRNA區(qū)段，其包含(i)能夠與靶序列雜交的引導(dǎo)序列，(ii)莖序列；

tracrRNA區(qū)段，其包含與所述莖序列部分或完全互補(bǔ)的核苷酸序列；和

第一銜接子區(qū)段，其包含與(i)供體多核苷酸、(ii)第二銜接子區(qū)段、或(iii)夾板區(qū)段互補(bǔ)的序列，并且所述銜接子序列包含一個(gè)或多個(gè)增強(qiáng)穩(wěn)定性的修飾；并且

所述供體多核苷酸附接于所述第一銜接子區(qū)段、所述第二銜接子區(qū)段或所述夾板區(qū)段之一。

9.權(quán)利要求8的引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物，其中所述供體多核苷酸通過堿基配對(duì)雜交附接于所述第一銜接子區(qū)段。

10.權(quán)利要求8的引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物，其中所述供體多核苷酸通過核苷酸間鍵附接于所述第一銜接子區(qū)段。

11.權(quán)利要求8的引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物，其中所述第一銜接子區(qū)段通過堿基配對(duì)雜交附接于所述夾板區(qū)段，并且所述夾板區(qū)段通過堿基配對(duì)雜交附接于所述供體多核苷酸。

12.一種編輯靶多核苷酸的方法，所述方法包括：

使所述靶多核苷酸與CRISPR相關(guān)蛋白以及前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的合成的引導(dǎo)RNA或引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物接觸，

切割所述靶多核苷酸，和

將供體多核苷酸接合至所述靶多核苷酸。

13.權(quán)利要求12的方法，其進(jìn)一步包括使所述靶多核苷酸與外源CRISPR相關(guān)蛋白接觸。

14.權(quán)利要求13的方法，其中所述CRISPR相關(guān)蛋白是Cas9。

15.權(quán)利要求12至14中任一項(xiàng)的方法，所述方法進(jìn)一步包括用所述供體多核苷酸通過同源定向修復(fù)來修復(fù)經(jīng)切割的靶多核苷酸。

16.權(quán)利要求15的方法，其中所述供體多核苷酸包含至少一個(gè)與位于切割位點(diǎn)任一側(cè)的序列具有實(shí)質(zhì)性序列同一性的序列。

17.權(quán)利要求12至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶多核苷酸在體外與所述CRISPR相關(guān)蛋白及所述合成的引導(dǎo)RNA或引導(dǎo)RNA:供體多核苷酸復(fù)合物接觸。