[發明專利]制備治療性蛋白質的方法

有效

• 申請號: 201680037233.6
• 申請日: 2016-04-27
• 公開（公告）號: CN108138214B
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發明（設計）人: R·體佳妮;達里爾·培根·桑佩;約翰·羅伯雷;魏甘;何朝梅
• 申請（專利權）人: 動量制藥公司;拜奧法克圖拉公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C12N15/00;C12Q1/04
• 代理公司: 北京安信方達知識產權代理有限公司 11262
• 代理人: 鄭霞

本發明公開了制備治療性蛋白質的方法。

發明背景

使用哺乳動物細胞表達系統生產治療性蛋白質在生物技術產業中越來越重要。已經描述了多種培養和轉染系統，但每一種都具有顯著的局限性。

發明內容

本文描述的發明部分地基于以下發現：膽固醇營養缺陷型細胞與一種或多種額外的選擇性標志物的組合可用于制備治療性蛋白質的方法，以避免與膽固醇營養缺陷型細胞相關的意外的制備問題(例如，低生產率)。在一方面，本公開內容的特征在于制備治療性蛋白質的方法，該方法包括：培養具膽固醇營養缺陷型和谷氨酰胺營養缺陷型的細胞；用以下核酸轉染所述細胞：(i)編碼能夠使所述細胞中的膽固醇生物合成恢復的蛋白質的核酸；(ii)編碼能夠使所述細胞中的谷氨酰胺生物合成恢復的蛋白質的核酸；以及(iii)編碼所述治療性蛋白質的核酸；在適合所述治療性蛋白質表達的條件下培養所述細胞；以及分離和/或純化所述治療性蛋白質。

在一個實施方案中，所述細胞為NS0細胞。

在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為抗體。在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為融合蛋白。在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為含Fc的融合蛋白。

在一些實施方案中，在所述轉染步驟中，用編碼抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸(iii)轉染所述細胞。在一些實施方案中，核酸(i)編碼3-酮基類固醇還原酶。在一些實施方案中，核酸(ii)編碼谷氨酰胺合成酶。

在一些實施方案中，第一表達載體包含核酸(i)和(iii)，并且第二表達載體包含核酸(ii)。在一些實施方案中，第一表達載體包含核酸(i)，并且第二表達載體包含核酸(ii)和(iii)。在一些實施方案中，第一表達載體的轉染在第二表達載體的轉染之前進行。在一些實施方案中，第一表達載體的轉染與第二表達載體的轉染同時進行。

在一些實施方案中，在不存在外源引入的膽固醇的情況下(例如，在核酸(i)轉染之后)培養所述細胞。在一些實施方案中，在不存在外源引入的谷氨酰胺的情況下(例如，在核酸(ii)轉染之后)培養所述細胞。在一些實施方案中，在存在谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如，甲硫氨酸亞砜亞胺)的情況下(例如，在核酸(ii)轉染期間和/或之后)培養所述細胞。在一些實施方案中，在存在3-酮基類固醇還原酶抑制劑的情況下(例如，在核酸(i)轉染期間和/或之后)培養所述細胞。

在一些實施方案中，在不存在外源引入的膽固醇并且不存在外源引入的谷氨酰胺的情況下培養所述細胞。在一些實施方案中，在不存在外源引入的膽固醇、不存在外源引入的谷氨酰胺并且存在谷氨酰胺合成酶抑制劑(例如，甲硫氨酸亞砜亞胺)的情況下培養所述細胞。在一些實施方案中，在不存在外源引入的膽固醇的情況下(例如，在核酸(i)轉染之后)培養所述細胞，并且在不存在外源引入的谷氨酰胺的情況下(例如，在核酸(ii)轉染之后)培養所述細胞。

在一方面，本公開內容的特征在于制備治療性蛋白質的方法，該方法包括：培養膽固醇營養缺陷型細胞；用以下核酸轉染所述細胞：(i)編碼能夠使所述細胞中的膽固醇生物合成恢復的蛋白質的核酸；(ii)編碼表達一種或多種選擇性標志物的蛋白質的核酸；以及(iii)編碼所述治療性蛋白質的核酸；在適合所述治療性蛋白質表達的條件下培養所述細胞；以及分離和/或純化所述治療性蛋白質。

在一個實施方案中，所述細胞為NS0細胞。

在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為抗體。在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為融合蛋白。在一些實施方案中，所述治療性蛋白質為含Fc的融合蛋白。

在一些實施方案中，在所述轉染步驟中，用編碼抗體輕鏈和抗體重鏈的核酸(iii)轉染所述細胞。

在一些實施方案中，核酸(i)編碼3-酮基類固醇還原酶。