[發明專利]血管平滑肌細胞的培養方法

在審

• 申請號: 201680007913.3
• 申請日: 2016-01-29
• 公開（公告）號: CN107208059A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發明（設計）人: 石井伊都子;金木達朗;北原真樹
• 申請（專利權）人: 日產化學工業株式會社;國立大學法人千葉大學
• 主分類號: C12N5/077
• 分類號: C12N5/077
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所11256
• 代理人: 楊宏軍

技術領域

本發明涉及血管平滑肌細胞的培養技術。

背景技術

構成血管的血管內皮細胞及血管平滑肌細胞(以下稱為血管細胞)常常作為原代培養細胞而被用于體外(in vitro)試驗，幾乎不存在已確立的細胞株。原代培養血管細胞與確立的細胞不同，殘留了較多的生物體內血管細胞本來的性質，另一方面，報道了若進行傳代培養、冷凍保存則容易發生形態性質變化的性質。尤其是，對于血管平滑肌細胞而言，若進行利用通常的培養板的培養(單層培養：二維培養)，則會導致增殖、收縮能力下降等形態性質的變化。作為避免這樣的形態性質變化的措施，開發了以下的3種方法。(1)在I型膠原凝膠上的培養。能在使增殖停止的狀態下培養血管平滑肌細胞(非專利文獻1)。(2)使用了以I型膠原蛋白為主成分的三維基體的培養(非專利文獻2)。這種情況下，細胞增殖停止，血管平滑肌細胞本來的收縮能力恢復。(3)血管內皮細胞的培養通常通過明膠包被(gelatin coat)而進行。

然而，各培養方法存在各自的問題。(1)的方法存在不適于長期培養的問題。因此，在培養第3～5天，需要將膠原凝膠溶解從而將血管平滑肌細胞分離。若不進行分離而保持原狀態進行培養，則細胞會開始增殖，從而變得等同于通常的二維培養。因此，無法維持與生物體相近的性質。(2)的使用了I型膠原蛋白三維基體的培養存在下述問題：到血管平滑肌細胞具有與生物體相近的性質為止需要約1周左右。此外，不能在經過培養的狀態下進行保存，因此難以進行臨床應用。(3)的使用了明膠包被的培養與通常的二維培養法沒有太大區別。

如上所述，當前實施的血管細胞的培養技術中，由于無法避免細胞的形態性質變化(二維培養法)、長期培養的困難性、煩雜性(三維培養法)，因而在利用血管細胞的評價方法的開發、血管細胞運輸方法、血管細胞的生物體移植等方面有較大限制。此外，即使通過利用抑制細胞粘附的材料涂覆培養容器表面、或對培養容器表面實施特殊的加工來抑制細胞粘附并培養血管平滑肌細胞，其存活率也快速下降。因此，期望開發下述培養方法：在將培養基材對血管細胞的刺激抑制在最小限度的同時，可實現能簡便地進行藥劑等的評價的培養環境、細胞不容易發生形態性質變化從而便于細胞回收及細胞運輸的非冷凍環境。

本申請的發明人已成功開發了能在不實質性地提高液體培養基中的粘度的情況下、維持懸浮狀態而對細胞、組織進行培養的培養基組合物(專利文獻1及2)。

現有技術文獻

專利文獻

專利文獻1：WO2014/017513 A1

專利文獻2：US2014/0106348 A1

非專利文獻

非專利文獻1：Koyama等,Cell 1996；87:1069-78

非專利文獻2：Ishii等,Atherosclerosis 2001；158:377-84

發明內容

發明所要解決的課題

本發明的目的在于提供一種在不使血管平滑肌細胞增殖的情況下、在避免形態性質變化的同時進行長期培養的技術。

用于解決課題的手段

本申請的發明人已經發現，在能在不實質地提高液體培養基中的粘度的情況下、維持懸浮狀態而對細胞、組織進行培養的培養基的組合物中懸浮培養癌細胞等時，與在培養板上進行粘附培養的情況相比，可促進細胞增殖(專利文獻1)；但是，在能維持懸浮狀態而對細胞、組織進行培養的培養基組合物中懸浮培養血管平滑肌細胞時，意外地發現，細胞周期反而在維持良好的存活性的狀態下中止，細胞增殖被抑制，從而能在避免形態性質變化的風險的同時長期維持。

基于這樣的見解而進一步進行研究，從而完成了本發明。

即，本發明如下所述：

[1]血管平滑肌細胞的培養方法，所述方法包括下述步驟：在含有能使細胞或組織懸浮而進行培養的結構體的培養基組合物中，懸浮培養血管平滑肌細胞。

[2]如[1]所述的方法，其中，懸浮培養處于已停止細胞增殖的狀態的血管平滑肌細胞。

[3]抑制血管平滑肌細胞的細胞增殖的方法，所述方法包括下述步驟：在含有能使細胞或組織懸浮而進行培養的結構體的培養基組合物中，懸浮培養血管平滑肌細胞。

[4]如血管平滑肌細胞的保存方法，所述方法包括下述步驟：使血管平滑肌細胞懸浮于含有能使細胞或組織懸浮而進行培養的結構體的培養基組合物中。

[5]如[1]～[4]中任一項所述的方法，其中，所述結構體包含脫酰基結冷膠。