[發明專利]一種構建長片段測序文庫的方法

有效

• 申請號: 201680003838.3
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN107002153B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 王歐;程小芳;章文蔚;鄒良英;常燦坤;蔣慧
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12M1/00;C40B50/06;C40B60/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明提供了一種構建長片段測序文庫的方法。本發明提供的方法包括如下步驟：1)制備含有單鏈DNA的5184孔板；2)將所述單鏈DNA等量分裝到5184孔板每個孔中；3)將全基因組擴增反應體系分裝到步驟2)處理后的5184孔板每個孔中，反應；4)將片段化反應液分裝到步驟3)處理的5184孔板每個孔中，反應；5)將步驟4)處理后的5184孔板每個孔中的核酸分子添加不同標簽序列，即得到測序文庫。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種構建長片段測序文庫的方法。

背景技術

新一代高通量并行測序儀使基因組學領域發生了革命性變化，基因測序所需成本和時間大大降低，同時一些新的應用，諸如宏基因組測序，基因結構變異和基因表達分析也被開發了出來。盡管如此，目前其他物種基因組的組裝，離達到人類基因組項目設定的標準的，常規的基因組還有非常長的距離。受限于測序原理和技術瓶頸，現有的高通量并行測序儀的測序讀長分布從幾百堿基到幾千堿基不等，而需要進行研究的基因組或基因組元件的或可多達幾億個堿基，這要求生物信息學家將這些片段化的信息重新還原成生物體本身的長片段染色體信息，即對測序生成的短片段進行組裝。

事實上，基因組的組裝效果受到很多方面的制約，除了制定的測序策略，測序數據質量，以及所使用的組裝軟件等人為因素外，待研究的基因組的自身特性也會影響基因組組裝的效果，其中較為重要的兩個因素是基因組中的重復區域和基因組的雜合程度。由于現有測序手段的讀長較短，無法跨越重復區域因而造成拼接失敗。而基因組的雜合程度過高則會導致組裝軟件將同源染色體單獨組裝出來，從而造成組裝的基因組偏離于基因組的真實情況。在不改變現有測序儀讀長的情況下，這些因素無法通過改進組裝拼接算法完全消除。此外，潛在的測序錯誤，以及文庫構建過程中擴增導致的偏向性及錯誤都會對組裝效果產生負面影響。

因此越來越多的研究者試圖通過在實驗設計方面進行改進從而提升基因組拼裝效果。針對基因組重復區域，傳統的方法一般通過增加文庫跳躍長度來輔助組裝，如構建不同長度的Mate pair jump文庫或Fosmid文庫，用于跨過不同大小的基因組重復區域。另外還可以采用混合測序類型的方法，如使用PacBio測序儀長讀長序列生成長腳手架序列，然后利用illumina測序儀的短讀長進行錯誤修正，從而達到較好的組裝效果。

而對于高雜合度引起的組裝問題，可以通過單倍型組裝定相(Phasing)來解決。即通過實驗手段將單倍體信息從多倍體信息中分離出來，從而使單倍體型被完整的組裝出來。目前已經有一些研究使用不同的研究手段獲得了樣品的單倍體型信息，這些手段包括：1.通過對樣品以及樣品的父本進行全基因組測序進而獲得樣品的單倍體型信息。2.通過使用Fosmid測序方法進行單倍體型測序。3.在細胞分裂中期，使用顯微操作技術將染色體分離并測序，進而獲得單倍體型信息。4.通過臨近隨機連接法進行單倍體測序。

然而，以上幾種單倍型定相方法均具有一定的局限性：1.同時對父代和子代樣本進行測序，然后根據基因型進行單倍型定相的方法要求同時擁有父本和母本的樣品，這大大限制了它的使用范圍，并且該方法無法對De novo突變進行檢測。2.使用Fosmid測序的方法需要至少一周的文庫制備時間，包含大量建庫實驗，因此該方法需要微克級的樣品作為起始。無法針對臨床少量樣品進行分析。3.染色體分離方法需要有復雜的專業顯微操作設備，同時要求實驗人員的操作水平非常高。4.受限于實驗原理，臨近連接法檢測到的突變體有限，只能檢測到80％左右的SNV，不能滿足臨床分析的需要。因此，為了應對個體化醫療的需要，急需一種高準確度，高覆蓋度，低成本，低起始量，實驗條件相對簡便的單倍體型測序技術。