[發明專利]一種構建長片段測序文庫的方法

有效

• 申請號: 201680003838.3
• 申請日: 2016-01-13
• 公開（公告）號: CN107002153B
• 公開（公告）日: 2020-10-27
• 發明（設計）人: 王歐;程小芳;章文蔚;鄒良英;常燦坤;蔣慧
• 申請（專利權）人: 深圳華大生命科學研究院;深圳華大基因科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C12M1/00;C40B50/06;C40B60/14
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

1.一種構建長片段測序文庫的方法，包括如下步驟：

1）制備含有單鏈DNA的5184孔板；

所述制備含有單鏈DNA的5184孔板的方法為如下A）或B）：

A）先提取待測樣品基因組DNA，變性，得到單鏈DNA，再將所述單鏈DNA分子分裝到5184孔板的每個孔中，得到含有單鏈DNA的5184孔板；

B）先將待測樣品分裝到5184孔板的每個孔中，再裂解變性，得到含有單鏈DNA的5184孔板；

所述單鏈DNA的片段長度不小于100Kb；

2）將全基因組擴增反應體系分裝到所述含有單鏈DNA的5184孔板的每個孔中，進行全基因組擴增反應，得到含有全基因組擴增產物的5184孔板；

3）將片段化反應體系分裝到所述含有全基因組擴增產物的5184孔板的每個孔中，進行片段化反應，得到片段化產物，含有所述片段化產物的孔板即為含有片段化產物的5184孔板；

所述片段化產物的長度為200-1500bp；

4）對所述含有片段化產物的5184孔板每個孔中片段化產物添加不同標簽序列，即得到測序文庫；

所述含有單鏈DNA的5184孔板中的單鏈DNA總量滿足5184孔板中每個孔內出現來自父母雙方相同基因組位置的同源染色體片段的概率小于1%；

所述含有單鏈DNA的5184孔板中的單鏈DNA總量具體為10-500個細胞的DNA量。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于：所述5184孔板每孔的容積為190納升至350納升。

3.根據權利要求2所述方法，其特征在于：所述5184孔板每孔的容積為200納升至350納升。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步驟1）中，所述變性或所述裂解變性采用的試劑為堿變性試劑；

所述變性的反應條件為25度孵育2分鐘；

所述裂解變性的反應條件為85攝氏度孵育2分鐘；

所述提取待測樣品基因組DNA的方法采用透析法或堿裂解法或瓊脂糖包埋法。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步驟2）中，所述全基因組擴增反應體系中含有由8個堿基組成的隨機引物。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

在步驟1）和步驟2）之間，還包括如下步驟：將由8個堿基組成的隨機引物分裝到所述含有單鏈DNA的5184孔板中。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步驟2）中，所述全基因組擴增反應體系為多重鏈置換聚合酶擴增反應體系；

所述全基因組擴增反應為30℃孵育1小時，再65℃孵育5分鐘；

或所述全基因組擴增反應為37℃孵育45分鐘，再65℃孵育5分鐘。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于：

步驟3）中，所述片段化反應體系為轉座酶反應體系；

所述轉座酶反應體系包括轉座酶反應緩沖液和包埋接頭的轉座酶；

所述片段化反應的條件為55℃孵育10分鐘；

所述接頭為接頭1和/或接頭2。