[發明專利]一種蛋白質化學交聯劑及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201611262823.7
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN107628937B
• 公開（公告）日: 2020-11-06
• 發明（設計）人: 雷曉光;亞歷山大·瓊斯;董夢秋;曹勇;譚惠
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: C07C49/84
• 分類號: C07C49/84;C07C45/64;C07C235/84;C07C231/12;G01N33/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 郭奧博

本發明涉及一種蛋白質化學交聯劑及所述蛋白質化學交聯劑的制備方法。本發明提供的多功能交聯劑水溶性以及穩定性均十分優異，且交聯效率高，尤其是對精氨酸的交聯效率高，是首次被廣泛使用的精氨酸特異交聯劑。本發明證明了所述交聯劑對精氨酸的選擇性，其與八個模式蛋白質和多亞基酵母蛋白復合物的交聯反應證明了這些交聯劑與精氨酸結合的有效性?；瘜W交聯與質譜分析結合技術是結構化學中一種有效且高速發展的技術，可以被有效地應用于大的活性蛋白質復合物分析，而不需要進行嚴格的純化過程。由于交聯劑多樣的結構特點，這些交聯劑展示出互補的反應性，其可交聯的精氨酸殘基彼此特異。

技術領域

本發明涉及蛋白質及其功能研究領域，具體涉及一種蛋白質化學交聯劑及其制備方法。

背景技術

蛋白質作為生命的物質基礎和生命活動的主要承擔者，研究蛋白質的功能對理解生命活動有重要意義。隨著人類基因組計劃的完成，過去十幾年鑒定到的蛋白質數量急劇增加。然而，許多新發現的蛋白質的生理功能仍然不清楚，與研究蛋白質功能密切相關的是蛋白的三維結構以及蛋白-蛋白相互作用。傳統的蛋白質結構解析方法X射線晶體學和核磁共振光譜學的分辨率可以達到原子水平。但是這兩種方法都需要大量的蛋白質，而且對X射線晶體學而言獲取質量很高的大分子量蛋白質或蛋白質復合體的晶體是非常困難的，核磁共振光譜學則要求蛋白質有較好的水溶性，且分子量一般低于30kDa。近年來興起的一個完全不同的途徑是化學交聯－質譜鑒定技術。它在大約二十年前就已開辟，但近幾年才發展成熟。該技術利用化學交聯劑(chemical cross linker)在相互作用的蛋白之間形成依賴于某些類型的氨基酸殘基及它們之間的空間距離的共價鍵，再通過質譜鑒定交聯位點；所述整個流程包括(如圖1所示)：1)蛋白質與交聯劑發生特異性的交聯反應；2)將蛋白酶切成肽段；3)質譜分析鑒定交聯的肽段。新興的單分子冷凍電鏡－三維重構技術常常不能確定大分子量蛋白質或蛋白質復合體的局部構象，所以也往往與化學交聯－質譜鑒定技術結合。分體式交聯劑與一體式交聯劑結構示意圖如圖2所示。

質譜技術的發展極大地推動了化學交聯劑的應用，這使得它廣泛應用于研究蛋白與蛋白的相互作用。這歸功于質譜技術與化學交聯劑的結合在研究蛋白與蛋白相互作用領域具有獨特的優勢，具體包括：1)化學交聯劑與相互作用的蛋白質之間是通過不可逆的共價鍵連接的，理論上可以檢測到其它方法很難捕獲的瞬時相互作用；2)由于質譜直接分析的是蛋白質水解后的多肽，因此蛋白質或蛋白復合物的大小是不受限制的；3)分析速度快，對樣品純度要求低，而且需要的蛋白在微克級別，具有很高的靈敏度；4)可供選擇的化學交聯劑種類很多，根據兩個反應官能團的差別可分為：氨基—氨基，氨基—巰基，巰基—巰基，巰基—羧基；同時兩個反應官能團之間的臂長也可以改變。

盡管已經有很多商業化的化學交聯劑，但是由于酶切產物大部分都是普通肽段，而交聯肽段所占比例很低，因此在如此復雜的體系中去鑒定交聯肽段是一項非常困難的任務。目前大部分交聯劑僅僅停留在簡單、純化的蛋白樣品分析，對復雜的生物樣品并沒能顯現出太大的解決能力。通過使用生物素對樣品進行純化富集可以實現交聯肽段與普通肽段的分離，這將大大減低樣品的復雜程度，因此可富集型交聯劑是當前發展的重點。同時，在交聯劑中引入可切割位點有利于交聯肽段在富集中從固相系統上釋放，而同位素的引入不僅能幫助交聯肽段的鑒定，更使得交聯肽段的定量成為可能。然而，簡單機械地將這些官能團拼湊在一起有時并不能實現它們自身的價值，不當的累加反而帶來負面效果，導致交聯劑水溶性降低、交聯效率不高、穩定性不好等問題。因此，如何將這些官能團有機地融合在一起，使它們發揮出自身的功能，成為能解決復雜生物樣品分析的化學交聯劑仍是一個巨大的挑戰。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種蛋白質化學交聯劑，其結構如通式I所示：

R1-X-R2 I；

所述通式I中，R1、R2各自獨立地選自以下基團：其中，所述Rx位于苯環的臨位或間位，選自-H、-OH、-OMe、或鹵素；

所述通式I中，X選自以下基團：