[發明專利]一種快速穩定的Tn5轉座酶酶活測定方法

在審

• 申請號: 201611250704.X
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265101A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 王磊;王亮;鄭春陽
• 申請（專利權）人: 天津強微特生物科技有限公司;華北理工大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種快速穩定的Tn5轉座酶酶活測定方法，包括以下步驟：（1）測活底物同轉座酶和反應緩沖液混合（2）進行轉座反應（3）加入變性劑（如SDS、鹽酸胍等）使轉座酶變性，分離轉座酶和DNA片段（4）加入夠識別底物標記的介質，結合未反應的底物（5）通過選擇性手段（如離心、過濾、濃縮等）去除結合了底物的介質（6）檢測釋放出的帶標記的DNA的含量，同標準數值比較，得到Tn5轉座酶的活性。該測活方法操作簡便、快速，結果重復性好，十分適合于大批量生產中Tn5轉座酶的酶活檢測。

技術領域

本發明涉及生物學技術領域，具體涉及一種快速穩定的Tn5轉座酶酶活測定方法。

背景技術

隨著測序技術的發展，高通量測序已經廣泛的應用于基因組學、轉錄組學、和醫學檢測等多個領域，高通量測序技術服務及其相關的測序建庫試劑耗材已經成為商業化生物技術產業的一個重要的分支。高通量測序技術包括建庫，測序反應和數據處理三個步驟，建庫步驟處理待測序的DNA，制備可用于測序的DNA片段；測序反應利用DNA聚合酶的合成反應，結合熒光檢測技術，測定DNA片段的序列；數據處理步驟比對和拼接所得的DNA片段序列，最終獲得完整的DNA序列。在這三個步驟中，測序反應步驟的自動化程度最高，主要步驟全部由測序儀器完成；數據處理步驟其次，由各類生物信息學軟件完成比對和拼接，部分較為困難的數據輔助人工分析和判斷；建庫步驟是自動化程度最低的步驟，需要大量的人工和試劑。

由于目前的高通量測序技術只能檢測短片段的DNA（約150-300bp），測定長片段DNA序列時，需要將長片段的DNA打斷成150-300bp的短片段，在片段兩端連接特定組合的接頭以便于測序數據的分析和拼接。這個過程就是建庫。根據打斷方法的不同，可以將建庫方法分為物理法和酶法，物理法包括霧化和超聲打斷DNA，酶法包括DNA片段化酶（Fragmentase）、DNA剪切酶（Shearase）和轉座酶（Tn5 Transposase）等，除轉座酶外，其他的所有建庫方法都包含打斷DNA，修復DNA片段和DNA片段加接頭幾個步驟，其中DNA片段加接頭一般通過DNA連接酶，需要耗費較多的時間。使用轉座酶建庫時，上述的三個步驟整合成為一體，僅一步就可以完成打斷DNA和DNA片段加接頭，可以使建庫反應在2個小時內完成。

Tn5轉座酶是IS4家族的復合轉座子Tn5內部由IS50序列編碼的轉座酶，包含476個氨基酸殘基，分子量53kDa。轉座酶能夠識別成對的末端序列（End sequence），經過“剪切和粘貼”的方式，完成轉座反應。轉座酶的轉座反應包括以下幾個步驟（圖1）：

首先，Tn5轉座酶識別供體DNA片段中的末端序列，兩個Tn5轉座酶分子結合，形成活性二聚體；活性二聚體在末端序列的外側切割雙鏈DNA，將末端序列和其間的DNA從供體DNA上切割下來；之后，活性二聚體同受體DNA結合，二聚體切割受體DNA，形成9bp的粘性末端；活性二聚體隨后催化末端序列同受體DNA片段的粘性末端連接，完成轉座反應。在體外的反應條件下，完成反應的Tn5轉座酶依然同受體DNA片段緊密結合，需要使用變性劑等失活Tn5轉座酶才能將其同受體DNA片段分離。目前在體內介導這一分離過程的機理還不太清楚。

目前已知的能夠被轉座酶識別的末端序列有OE（Outer end，SEQ ID NO 1），IE（Inner end，SEQ ID NO 2）和ME（Mosaic end，SEQ ID NO 3），OE和IE分別是Tn5轉座子中IS50序列的外末端序列和內末端序列，轉座酶對于OE的選擇性高于IE；ME序列是經過突變優化后的序列，轉座酶對于ME的選擇性高于OE序列。