[發明專利]生產L-谷氨酰胺的菌株和生產L-谷氨酰胺的方法

有效

• 申請號: 201611250325.0
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106701649B
• 公開（公告）日: 2021-06-22
• 發明（設計）人: 胡丹;王成;刁劉洋;毛賢軍
• 申請（專利權）人: 廊坊梅花生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P13/14;C12R1/15
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及食品工業技術領域，尤其涉及生產L?谷氨酰胺的菌株和生產L?谷氨酰胺的方法。本發明研究表明，單獨pyc改造不能提高谷氨酸棒桿菌積累谷氨酰胺的能力，但pyc改造與odhA弱化改造配合，則可以大幅提高谷棒產谷氨酰胺的水平。說明，pyc高表達與odhA弱化表達，對合成谷氨酰胺具有協同促進作用。本發明以保藏編號為CGMCC No.13404的谷氨酸棒桿菌為出發，通過弱化odhA及增強pyc的表達水平，構建得到L?谷氨酰胺基因工程改造菌。該菌株能夠實現發酵過程中L?谷氨酰胺的高效積累，L?谷氨酰胺可達28.9g/L。

技術領域

本發明涉及食品工業技術領域，尤其涉及生產L-谷氨酰胺的菌株和生產L-谷氨酰胺的方法。

背景技術

谷氨酰胺不僅是合成蛋白質的基本氨基酸之一，還是許多重要化合物如嘌呤、嘧啶，及其它氨基酸合成的氨基供體。谷氨酰胺能夠對抗消化道潰瘍，維持正常的腸胃功能，保證氮代謝平衡，及調節人體正常的酸堿平衡，具有重要的免疫和營養功能。

目前，谷氨酰胺的主要生產方法為微生物發酵法，微生物發酵法反應條件溫和，產品原料豐富，逐步取代了傳統的酶法和化學合成法。在高NH⁴⁺、低pH的的情況下，谷氨酸經谷氨酰胺合成酶催化生成谷氨酰胺。人們在從谷氨酸生產菌中篩選谷氨酰胺生產菌方面做了許多研究。事實上，現在的谷氨酰胺生產菌有很多都是從谷氨酸生產菌谷氨酸棒桿菌改造而來。

近年來，隨著谷氨酸棒桿菌模式菌株ATCC 13032基因組測序的完成，以及棒桿菌基因操作技術的不斷完善，使得通過分子生物學手段對谷氨酸棒桿菌進行相關改造成為現實。谷氨酰胺在生物體內的合成途徑也已相繼報道。

腺苷酰轉移酶(ATase)是谷氨酰胺合成酶(GS)的腺苷酰化修飾酶。所謂腺苷酰化修飾就是AMP以共價鍵方式與肽鏈上的酪氨酸殘基結合產生GS(AMP)的過程，GS的腺苷酰化和去腺苷酰化都由腺苷酰轉移酶催化。腺苷酰化會使GS的活性降低或喪失。另外，GS的腺苷酰化修飾失活及其逆過程也受到銨離子濃度的調控。在限制銨鹽的培養條件下，生長到穩定期的細胞內的GS是未被腺苷酰化修飾的。而在過量銨鹽的培養條件下，腺苷酰化程度增強，GS酶活力下降甚至失活(黃星，過程工程學報.2008,8(1):135-139)。因此，解除對GS的腺苷酰化修飾作用可以很大程度提高L-谷氨酰胺的產量。

谷氨酸棒桿菌中存在谷氨酰胺酶(GLS)，該酶可分解谷氨酰胺成為谷氨酸。高銨離子濃度和低pH可抑制該酶的活性。傳統谷氨酰胺發酵中，通過降低發酵中后期培養基的pH，可實現高谷氨酰胺積累。在谷氨酸棒桿菌中缺失該基因，可減少谷氨酰胺的分解代謝。

雖然上述舉措都實現里利用谷氨酸棒桿菌來生產L-谷氨酰胺，但谷氨酰胺的產量仍有待進一步的提高。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供生產L-谷氨酰胺的菌株和生產L-谷氨酰胺的方法，本發明提供的生產L-谷氨酰胺的菌株能夠將谷氨酰胺的產量提高至28.9g/L。

本發明提供了弱化odhA表達的重組菌株；其起始菌株為谷氨酸棒桿菌；弱化為使odhA基因的起始密碼子由ATG突變為GTG。

α-酮戊二酸是谷氨酸的直接前體，而后者又是谷氨酰胺的直接前體。本發明將odhA的表達弱化，以期使更多代謝流從TCA循環的α-酮戊二酸節點通往谷氨酸合成方向，繼而在增強的谷氨酰胺合成酶的作用下，積累更高量的谷氨酰胺。本發明通過進一步修飾該谷氨酰胺產生菌的odhA基因(編碼α-酮戊二酸脫氫酶E1o亞基)，降低該基因的表達水平，從而減弱了α-酮戊二酸的進一步氧化脫羧，導致更多代謝流從TCA循環進入谷氨酸及谷氨酰胺合成方向。修飾手段為將odhA編碼基因的起始密碼子由ATG改為GTG，降低該基因的起始翻譯效率。

本發明中，重組菌株包括編碼突變pyc蛋白的DNA分子，所述突變pyc蛋白具有P458S突變。