[發明專利]標志物及其應用、試劑盒、該標志物的檢測方法

有效

• 申請號: 201611248659.4
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106644985B
• 公開（公告）日: 2021-02-05
• 發明（設計）人: 樓建榮
• 申請（專利權）人: 廣州市雷德生物科技有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N33/68
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及生物技術領域，特別涉及標志物及其應用、試劑盒、該標志物的檢測方法。本發明利用內源瓜氨酸化抗原與ACPA可以形成抗原抗體免疫復合物的原理，尋找和摸索一種瓜氨酸化抗原抗體免疫復合物的檢測方法及相關ELISA試劑盒，不僅可以反映ACPA的水平，還可以反映瓜氨酸化抗原抗體免疫復合物的水平，并且瓜氨酸化抗原抗體免疫復合物與疾病狀態相關聯，其量的變化可以直接反映病情的進展情況和治療的效果評價，以實現快速、準確、方便診斷和評價RA的目的。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及標志物及其應用、試劑盒、該標志物的檢測方法。

背景技術

類風濕關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種主要以關節滑膜炎癥反應為病理改變的慢性自身免疫性疾病。RA的病變過程與患者體內產生多種自身抗體并與相應抗原形成抗原抗體免疫復合物(ICs)密切相關，部分循環中的ICs可反復沉積于關節滑膜組織，通過激活補體系統級聯反應引起滑膜炎癥，造成關節損傷。RA患者關節液和血清中的ICs可促進軟骨細胞的生長、NO的生成和細胞凋亡，提示ICs在RA發病中扮演著重要的作用。ICs在RA檢測中具有較高的敏感性，ICs持續增高常提示RA患者預后較差。

只有含有IgG和IgM類抗體的復合物才能活化補體的經典途徑而引起炎癥。這兩類抗體在血清中含量較大，是構成免疫復合物的主要抗體；可溶性抗原與相應抗體形成的較大免疫復合物活化補體的能力較強。IgG抗體為雙價，可與相應的多價抗原交互結合形成較大的免疫復合物；IgM分子可形成更大的免疫復合物。抗原－抗體親和力高時易形成大而穩定的免疫復合物。RA患者關節液和血清中存在較高水平的瓜氨酸肽與ACPA形成的免疫復合物，正常情況下，抗原抗體復合物在機體中被吞噬清除，然而在病例狀態下，ICs可誘發炎癥反應。

RA發病過程中伴隨多種免疫活性細胞如T細胞、B細胞、巨噬細胞、滑膜成纖維細胞(Fibroblast-like synovicyte,FLS)和中性粒細胞等的活化及細胞因子(IL6、TNF-α)、趨化因子和炎性介質的釋放。RA FLS增殖與局部關節炎癥和血管翳形成、骨破壞密切相關，FLS增殖和細胞因子分泌異常在RA發病過程中發揮關鍵作用。RA血清中存在含有瓜氨酸化蛋白與ACPA的ICs具有促FLS增殖能力，并可刺激FLS分泌更多細胞因子，參與RA發病機制。

自身免疫性是類風濕關節炎的主要特征,最佳例證是血漿中可檢測出高滴度的自身抗體,其中研究最為透徹的是類風濕因子(rheumatoid factors，RF)，但RF不只在RA中出現,也可見于正常人,并在其他一些疾病中升高。近年來，抗瓜氨酸化蛋白抗體(anti-citrullinated protein antibodies，ACPA)雖然在RA常規診斷中尚未完全取代RF的地位，但其已成為診斷RA的首選指標。總體而言，ACPA與RF敏感性相近，但特異性更高。這些抗體識別轉錄后被瓜氨酸化的多種蛋白，包括聚絲蛋白(filaggrin)、波形蛋白(vimentin)、α和β纖維蛋白(α-andβ-fibrin)、α-烯醇化酶(α-enolase)及I型和Ⅱ型膠原多肽(Type I andtype Ⅱcollagen)。

ACPA的檢測是通過ELISA法檢測血清對環瓜氨酸多肽(CCP)的反應。最初的臨床檢驗以檢測抗瓜氨酸化聚絲蛋白的環狀多肽的反應為基礎，因為環瓜氨酸多肽與天然構象表位更為接近，從而提高的實驗結果的準確性。目前這一實驗已被結果更準確的第二代試驗——抗CCP2Elisa——所取代，它使用從瓜氨酸化多肽庫中篩選的瓜氨酸化多肽，這些瓜氨酸化的多肽均為人工合成。近期研究顯示瓜氨酸化殘基可在肺和滑膜表達，ACPA的產生可能為肽基精氨酸脫亞胺酶(Peptidylarginine deiminase，PAD)介導的蛋白在肺及滑膜脫亞氨基作用而致。這些蛋白可被特異性抗原遞呈細胞或通過B細胞形成的免疫復合物所攝取，并遞呈給T細胞，促進激活ACPA反應性B細胞。

目前關于RF的檢測特異性較低；采用人工合成瓜氨酸化多肽用于ACPA的檢測，僅可以反映自生抗體的水平，且ACPA水平未必與疾病狀態相關聯。