[發(fā)明專利]檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611236665.8
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106754435B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉龍;殷嫻;陳堅;堵國成;李江華
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12P7/48;C12R1/685;C12R1/69;C12R1/66
• 代理公司: 蘇州市中南偉業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32257
• 代理人: 楊慧林

本發(fā)明涉及一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：構(gòu)建HGT1蛋白表達框，HGT1蛋白表達框內(nèi)包含組成型啟動子、與組成型啟動子連接的HGT1蛋白編碼基因以及與HGT1蛋白編碼基因連接的終止子；構(gòu)建抗性基因表達框，抗性基因表達框內(nèi)包含組成型啟動子、與組成型啟動子連接的hph基因以及與hph基因連接的終止子；將HGT1蛋白表達框和抗性基因表達框轉(zhuǎn)化到霉菌中，得到重組霉菌。本發(fā)明同時提供一種采用上述方法構(gòu)建的HGT1蛋白表達框和重組霉菌。本發(fā)明同時公開了一種采用上述方法構(gòu)建的重組霉菌在發(fā)酵生產(chǎn)檸檬酸中的應(yīng)用。本發(fā)明通過啟動高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白表達，進而提高霉菌中檸檬酸的產(chǎn)量，且發(fā)酵時間大大縮短。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

黑曲霉是重要的工業(yè)生產(chǎn)菌，目前對黑曲霉進行代謝改造的研究集中于中心代謝通路和呼吸鏈的改造，包括糖酵解途徑、TCA循環(huán)、rTCA循環(huán)的關(guān)鍵酶的單基因表達和基因協(xié)同表達，以及交替氧化酶的過量表達和敲除，但這些改造對檸檬酸產(chǎn)量的影響甚微，上述方法中只有增強rTCA循環(huán)途徑促進了檸檬酸產(chǎn)量的提高。

在檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中，原料為淀粉，淀粉經(jīng)過淀粉酶液化后過濾，得到清液和混液，通過清液和混液進行勾兌得到種子和發(fā)酵培養(yǎng)基，此時培養(yǎng)基中約一半的碳源為葡萄糖，另一半碳源以多聚葡萄糖的形式存在。而工業(yè)生產(chǎn)菌在發(fā)酵初期合成大量糖化酶，將多聚葡萄糖分解為葡萄糖，因此，在發(fā)酵前期培養(yǎng)基中碳源基本以葡萄糖的形式存在，所以檸檬酸發(fā)酵對碳源的吸收實際上是指對葡萄糖的吸收。

Torres測定了黑曲霉吸收葡萄糖存在2個Km值，分別為260μM和3.67mM，說明存在高親和力和低親和力兩套轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，而且由低親和力的轉(zhuǎn)運系統(tǒng)提供檸檬酸發(fā)酵所需的代謝流，但該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)僅在葡萄糖濃度>50g·L^-1時起作用。因葡萄糖的轉(zhuǎn)運是檸檬酸發(fā)酵的第一個步驟，該轉(zhuǎn)運系統(tǒng)對檸檬酸發(fā)酵有直接的影響，因此調(diào)整檸檬酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中的葡萄糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，有可能增強檸檬酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法及應(yīng)用，通過啟動高親和力葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達，以增強葡萄糖在發(fā)酵后期的吸收，進而提高了霉菌中檸檬酸的發(fā)酵產(chǎn)量。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

在一方面，本發(fā)明提供了一種檸檬酸產(chǎn)量提高的重組霉菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)構(gòu)建HGT1蛋白表達框，HGT1蛋白表達框包含組成型啟動子、與組成型啟動子連接的HGT1蛋白編碼基因以及與HGT1蛋白編碼基因連接的終止子；

(2)構(gòu)建抗性基因表達框，抗性基因表達框包含組成型啟動子、與組成型啟動子連接的hph基因以及與hph基因連接的終止子；

(3)將步驟(1)HGT1蛋白表達框和步驟(2)得到的抗性基因表達框轉(zhuǎn)化到霉菌中，得到重組霉菌。

進一步地，在步驟(1)中，HGT1蛋白編碼基因來源于黑曲霉。

進一步地，在步驟(1)中，HGT1蛋白編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

進一步地，HGT1蛋白編碼基因具有轉(zhuǎn)運葡萄糖的功能，其編碼的氨基酸序列可發(fā)生1個或多個氨基酸的取代、缺失或插入。

優(yōu)選地，HGT1蛋白編碼基因編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

進一步地，在步驟(1)中和步驟(2)中，組成型啟動子為PgpdA啟動子、gpdA啟動子、Pmbf啟動子或Pgla啟動子。

進一步地，PgpdA啟動子的序列如SEQ ID NO.3所示。