[發明專利]一種多基因疊加共轉化提高油菜綜合抗逆性的方法

有效

• 申請號: 201611225064.7
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106834345B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: 王道杰;楊翠玲;王再青;宋純鵬;張驍
• 申請（專利權）人: 河南大學
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/20;A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 鄭州聯科專利事務所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時立新

本發明屬于植物基因工程研究技術領域，具體涉及一種多基因疊加共轉化提高油菜綜合抗逆性的方法。該方法包括：多基因植物表達載體的構建、載體的鑒定、載體轉化農桿菌、制備轉化液、浸花法轉化油菜、篩選、鑒定、自交獲得純合體等步驟；所述多基因植物表達載體中，包含依次串聯的5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因，具體排列順序為：LB?HYG–GUS?BAR?ICE1?LOS5?CBF3?ABAR?NCED3?RB。本發明通過優化抗性基因組合，并將多個抗逆關鍵節點基因構建于同一表達載體中。在將該載體轉化植物體后，一次轉化即可使植物體能夠同時適應多種逆境條件，提高植物的綜合抗逆能力，表現較好的生產應用價值。

技術領域

本發明屬于植物基因工程研究技術領域，具體涉及一種多基因疊加共轉化提高油菜綜合抗逆性的方法。

背景技術

油菜屬十字花科 (Cruciferae) 蕓薹屬 (Brassica)，是世界上最重要的油料作物之一，其應用遍及生產生活的各個領域。當前油菜育種工作者面臨的主要問題是培育油菜高抗新品種來適應因全球氣候變化導致的非生物和生物脅迫日漸頻繁等問題。利用遺傳工程改良油菜品種在一定程度上克服了傳統育種模式基因交流范圍局限性的問題，是油菜育種工作可資利用的有效途徑之一。

干旱、鹽堿化、極端氣候等非生物脅迫嚴重影響作物產量潛力的發揮。干旱所造成的損失幾乎是其它自然災害所造成損失的總和。因此，如何通過提高作物的抗逆能力來增加作物產量，已成為農業可持續高效發展的重大需求。作物抗逆育種的主要任務就是聚合存在于不同種質資源中的有利基因，為農業生產培育優良的品種。由于植物耐逆性是多基因控制的復雜的數量性狀，不同抗逆信號通路之間又存在交叉對話，因此，相對于單基因轉化，將抗逆信號通路中的關鍵節點基因采用多基因疊加共轉化的方式提高植物的抗逆性具有許多不可替代的優點。但現有技術中尚未見到這一方面較好的應用報道。

發明內容

本發明目的在于一種多基因疊加共轉化以提高油菜綜合抗逆性的方法，該方法通過多基因疊加共轉化，將含五種抗逆基因表達載體同時轉入油菜，從而提高油菜對多種脅迫的綜合適應能力。

本發明所采取的技術方案詳述如下。

一種多基因疊加共轉化提高油菜綜合抗逆性的方法，包括如下步驟：

（1）多基因植物表達載體的構建

通過Gateway技術，結合Cre/Loxp重組系統和λ噬菌體位點特異性重組系統，以多輪重組疊加的方式構建了pABA-oriT載體，該載體的T-DNA區的克隆基因表達盒包含了依次串聯的5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因；

所述5種抗逆功能基因包括：2個ABA合成相關基因NCED3、LOS5，1個ABA信號途徑相關基因ABAR，2個抗凍調節基因 ICE1、CBF3；

所述3種選擇標記基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草銨膦抗性基因 BAR；

5種抗逆功能基因和3種選擇標記基因在pABA-oriT載體T-DNA區的具體排列順序為：LB-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

需要解釋的是：

5種抗逆功能基因由2類啟動子進行驅動表達，具體而言：