[發(fā)明專利]一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611225064.7
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106834345B
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王道杰;楊翠玲;王再青;宋純鵬;張驍
• 申請（專利權(quán)）人: 河南大學(xué)
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;C12N15/65;A01H5/00;A01H6/20;A01H1/02;A01H1/04
• 代理公司: 鄭州聯(lián)科專利事務(wù)所(普通合伙) 41104
• 代理人: 時(shí)立新

1.一種多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）多基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建pABA-oriT載體，該載體的T-DNA中的克隆基因表達(dá)盒包含依次串聯(lián)的5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因；

所述5種抗逆功能基因包括：2個(gè)ABA合成相關(guān)基因NCED3、LOS5，1個(gè)ABA信號途徑相關(guān)基因ABAR，2個(gè)抗凍調(diào)節(jié)基因 ICE1、CBF3；

所述3種選擇標(biāo)記基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草銨膦抗性基因 BAR；

5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因在pABA-oriT載體T-DNA區(qū)的具體排列順序?yàn)椋篖B-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

（2）對步驟（1）中所構(gòu)建的重組表達(dá)載體的鑒定，確保5種功能基因共存于同一表達(dá)載體中；

重組表達(dá)載體鑒定時(shí)，采用PCR鑒定法，PCR鑒定時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

（3）對步驟（2）中鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制備轉(zhuǎn)化液；

（4）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化油菜，轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)培育至成熟，按單株收獲種子；轉(zhuǎn)化油菜時(shí)，花序在轉(zhuǎn)化液中每次浸泡90~120秒；轉(zhuǎn)化操作時(shí)，隔天轉(zhuǎn)化1次，連續(xù)轉(zhuǎn)化3次；

（5）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定，將步驟（4）中所收獲油菜種子播種，依次進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性篩選，并對雙抗性植株進(jìn)行PCR鑒定；

（6）轉(zhuǎn)化體自交獲得純合體，對步驟（5）中篩選、鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)培養(yǎng)，于花期時(shí)套袋，使其自交，收獲單株種子；

對收獲的種子繼續(xù)種植，同步驟（5）操作，繼續(xù)進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鑒定，并對鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)自交，經(jīng)不少于4代的連續(xù)自交鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)化純合體，即為具有綜合抗逆特性的轉(zhuǎn)基因油菜。

2.如權(quán)利要求1所述多基因疊加共轉(zhuǎn)化提高油菜綜合抗逆性的方法，其特征在于， 步驟（4）中，所述油菜品種為甘藍(lán)型油菜Y42。

3.一種具有綜合抗逆性油菜新品種的培育方法，其特征在于，該方法以甘藍(lán)型油菜Y42為基礎(chǔ)，通過利用多基因疊加共轉(zhuǎn)化來提高油菜綜合抗逆性，所述多基因疊加共轉(zhuǎn)化包括如下步驟：

（1）多基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建

構(gòu)建pABA-oriT載體，該載體的T-DNA中的克隆基因表達(dá)盒包含依次串聯(lián)的5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因；

所述5種抗逆功能基因包括：2個(gè)ABA合成相關(guān)基因NCED3、LOS5，1個(gè)ABA信號途徑相關(guān)基因ABAR，2個(gè)抗凍調(diào)節(jié)基因 ICE1、CBF3；

所述3種選擇標(biāo)記基因包括潮霉素抗性基因HYG 、GUS和草銨膦抗性基因 BAR；

5種抗逆功能基因和3種選擇標(biāo)記基因在pABA-oriT載體T-DNA區(qū)的具體排列順序?yàn)椋篖B-HYG –GUS-BAR- ICE1- LOS5 -CBF3-ABAR-NCED3-RB；

（2）對步驟（1）中所構(gòu)建的重組表達(dá)載體的鑒定，確保5種功能基因共存于同一表達(dá)載體中；

重組表達(dá)載體鑒定時(shí)，采用PCR鑒定法，PCR鑒定時(shí)，引物序列設(shè)計(jì)如下：

NCED –F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

NCED-R：5' TAGTGTTGGATTCTTTGGCTTTGG 3'；

ABAR-F：5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

ABAR-R：5’ ACTTTAATCGCCAATTCCTCGACG 3’；

CBF–F： 5' AACTTAGTGAGACCCTCCTCTGTT 3'，

CBF-R： 5’ TTGAAATGTTCCGAGCCAAATCCT 3’；

LOS5-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

LOS5-R：5’ CTATAAGGTCACTGGTGGCCGAAC 3’；

ICE1-F：5’ ATAGATACGCTGACACGCCAAGCC 3’，

ICE1-R：5’ CTCTTCCCTTTCTCCACCACCACC 3’；

（3）對步驟（2）中鑒定正確的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，制備轉(zhuǎn)化液；

（4）采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法轉(zhuǎn)化油菜，轉(zhuǎn)化后，繼續(xù)培育至成熟，按單株收獲種子；轉(zhuǎn)化油菜時(shí)，花序在轉(zhuǎn)化液中每次浸泡90~120秒；轉(zhuǎn)化操作時(shí)，隔天轉(zhuǎn)化1次，連續(xù)轉(zhuǎn)化3次；

（5）轉(zhuǎn)化體的篩選和鑒定，將步驟（4）中所收獲油菜種子播種，依次進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性篩選，并對雙抗性植株進(jìn)行PCR鑒定；

（6）轉(zhuǎn)化體自交獲得純合體，對步驟（5）中篩選、鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)培養(yǎng)，于花期時(shí)套袋，使其自交，收獲單株種子；

對收獲的種子繼續(xù)種植，同步驟（5）操作，繼續(xù)進(jìn)行Basta抗性、潮霉素抗性、PCR鑒定，并對鑒定正確的轉(zhuǎn)化體繼續(xù)自交，經(jīng)不少于4代的連續(xù)自交鑒定，最終獲得轉(zhuǎn)化純合體，即為具有綜合抗逆特性的轉(zhuǎn)基因油菜。