[發明專利]一種以膽酸為配基的混合模式色譜填料的制備與應用

在審

• 申請號: 201611213454.2
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108236934A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 王驪麗;任怡;高棟
• 申請（專利權）人: 西北大學
• 主分類號: B01J20/286
• 分類號: B01J20/286;B01D15/36;C07K1/20;C07K1/18
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本發明提供一種制備和應用以膽酸為配基的具有高效疏水相互作用/弱陽離子交換混合模式色譜填料的方法。將膽酸作為固定相配基，在硅膠基質表面化學修飾獲得了新型的混合模式色譜填料。該填料裝填的色譜柱采用鹽?水為洗脫體系，對天然蛋白質分離具有高的選擇性和負載量且性能穩定；將其應用于雞蛋清樣品的分離，可分別在HPHIC模式和HPWCX模式下，獲得純度為99.9％的卵球蛋白(ovoglobulin)和99.8％的卵轉鐵蛋白OVT(ovotransfemin)，其蛋白質量回收率均在97％以上。

發明領域

本發明涉及一種以膽酸為配基，疏水相互作用為主，陽離子靜電作用為輔的模式色譜填料的制備方法及其用于雞蛋清的純化與分離，屬于高效液相色譜技術和天然生物大分子分離純化技術交叉領域。

背景技術

目前，已有許多類型的混合模式色譜(MMC)迅速發展，常見的有反相液相色譜(RPLC)/離子交換色譜(IEC)、RPLC/親水相互作用色譜(HILIC)；HILIC/IEC、疏水相互作用色譜(HIC)/IEC或IEC/HIC，其中由于HIC/IEC和IEC/HIC模式具有分離條件溫和，組分活性回收率高，色譜重現性好，以及流動相成本低、對環境污染小等特點，顯示出優越的應用前景[Johansson B.L.，Belew M.，Eriksson S.，Glad G.，Lind O.，Maloisel J.L.，NorrmanN.Journal of Chromatography A，2003，1016：21-33.]。研究表明，在MMC法中，一種是多重作用力均具有主要作用的保留模式，另一種是主、輔機理的LC模式保留機制。前者如Geng等報道的單柱二維液相色譜(2D-LC-1C)不但打破了一維模式分離的局限性，還節省了色譜材料，縮短了分離所需時間[Geng X.D.，Ke C.Y.，Chen G.，Liu P.，Wang F.，Zhang H.Q.，Sun.X.Journal of Chromatography A，2009，1216：3553-3562.]。后者如用一種具有一個疏水基團(苯基)和一個帶電基團(氨基)的苯乙胺分子作為配基制備的硅膠填料，在以疏水相互作用(HIC)為主，弱陰離子交換(WAX)為輔的MMC模式下對可以實現還原變性溶菌酶復性與同時純化[Gao D.，Tan F.C.，Wang W.P.，Wang.L.L.Chinese Chemical Letters，2013，24：419-421.]。在以往報道中，我們用膽固醇作為配基制備了一種高效疏水相互作用色譜(HPHIC)固定相，研究顯示，該固定相疏水性適中可以實現酸性蛋白胰島素(Insulin，pI5.0)，中性蛋白肌紅蛋白(myoglobin，pI 7.0)以及3種堿性蛋白(α-chymotrypsin A，pI9.2；cytochrome c，pI 9.4；lysozyme，pI 11)的基線分離，完全顯示出HIC法保留機制[Yang Y.C.，Qu Q.，Li W.M.，Yuan J.，Ren Y.，Wang L.L.Journal of SeparationScience，2016，39：2481-2490]。

膽酸是膽固醇的一種衍生物，學名3α，7α，12α-三羥膽烷酸，是人類四種主要膽汁酸中含量最豐富的一種。通常膽酸可通過乙醇結晶法、乙酸乙酯分離法從動物膽汁中提取。膽酸分子含有特殊的羧基、羥基的親水基團和多環剛性的疏水基團，與膽固醇分子結構上相似，但其基團完全不同。

本發明以膽酸分子作為色譜配基，制備一種以硅膠為基質，疏水相互作用為主，陽離子靜電作用為輔的混合模式色譜填料，并將該填料應用于雞蛋清的純化與分離。

發明內容

本發明的目的在于將膽固醇的一種衍生物膽酸作為色譜填料配基，制備一種以疏水作用為主，陽離子靜電作用為輔的混合模式色譜填料，該固定相是一種性能穩定、具有高選擇性的高效疏水相互作用/弱陽離子交換混合模式色譜固定相，將該填料應用于雞蛋清的純化與分離，分別在高效疏水相互作用模式和弱陽離子交換模式下，獲得純度為99.8％的卵球蛋白(ovoglobulin)和99.5％的卵轉鐵蛋白OVT(ovotransfemin)，其蛋白質量回收率均在96％以上。