[發明專利]一種副流感病毒一步法熒光分型RT-PCR檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611206542.X
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN108239676A
• 公開（公告）日: 2018-07-03
• 發明（設計）人: 遲大利;吳大治;夏懿
• 申請（專利權）人: 上海星耀醫學科技發展有限公司;上海復星醫藥（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種副流感病毒一步法熒光分型RT?PCR檢測試劑盒，試劑盒包括RT?PCR反應液、RT?PCR酶混合物、副流感病毒分型引物探針、內參、陰性對照、臨界陽性對照、強陽性對照。本發明可對提取好的副流感病毒RNA直接進行一步法RT?PCR反應，對樣本中的副流感病毒RNA進行熒光分型檢測，并依靠內參基因序列作為內對照、利用UNG酶預防污染。本發明的試劑盒一步法擴增方法簡單、程序簡短、操作簡便、預防污染，檢測結果特異性強、敏感度高、結果明晰、可信度高，可用于人鼻咽拭子樣本中1型、2型和3型副流感病毒熒光分型檢測。

技術領域

本發明屬生物技術領域，涉及一種生物檢測技術，尤其涉及一種用于副流感病毒熒光分型檢測試劑盒。

背景技術

副流感病毒（Human Parainfluenza viruses, HPIV）為單股負鏈RNA病毒，病毒表面含有融合酶和紅血球凝聚素—神經氨酸苷酶的糖蛋白刺。副流感病毒是引發成年及兒童下呼吸道感染的主要病原體。感染癥狀為感冒發燒、喉炎及支氣管炎等。HPIV病毒可對人體重復感染，尤其是老年及免疫功能低下的患者。

副流感病毒感染人的潛伏期是3~7天，與流感一樣屬于自限性疾病，一般6～7天自行痊愈。但它對人體危害主要是會引起嚴重的肺部并發癥，所以在治療上一般可以進行對癥治療，即有支氣管炎就治支氣管炎，有肺炎就治肺炎。而在預防上，除了上述一些措施外，普通居家中還可以用醋酸、八四消毒液等消毒劑消毒。

人類副流感病毒有四種血清型（1~4型），每種血清型有不同的臨床及流行病學特征：1型和2型副流感病毒為導致兒童肺炎的主要病原體，3型副流感病毒與毛細支氣管炎和肺炎表現出更多的相關性；根據文獻報道，4型副流感病毒較難獲得較高的細胞培養回收率，可導致輕度呼吸系統疾病，且在大多數臨床病毒學實驗室尚未被納入常規的呼吸道病毒檢測。副流感病毒尤其是1型副流感病毒呈全球流行態勢，每年大約有41000美國人因副流感病毒感染住院。因此，對1型、2型和3型副流感病毒的分型檢測有助于臨床診斷及指導醫生對患者合理用藥。

對人類副流感病毒的確診或流行監測應進行實驗室檢查，主要包括病毒分離培養、血清學診斷和快速診斷方法。近年來，分子生物學方法不斷被應用到流感病毒的快速檢測中，流感病毒的實驗室診斷方法取得了很大的進展，核酸檢測已經成為了流感病毒實驗室診斷的發展方向。

當前，基于TaqMan探針技術的熒光定量PCR是融匯了PCR高敏感性、DNA雜交技術高特異性和光譜技術高精確定量三大技術的一種新的檢測方法，該方法取材簡單，操作方便，完全封閉式操作避免了檢測時的標本被污染和對環境的污染，具有簡便、微量、快速、高特異、高敏感等優點。因此，熒光定量PCR法是臨床早期診斷病毒感染的最有價值的方法之一。

TaqMan探針技術是高度特異的熒光定量PCR技術。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’-末端，淬滅基團在探針3’-末端。當探針完整或與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’-端的淬滅基團接近而被淬滅，無熒光信號產生。在進行PCR反應延伸過程時，TaqDNA聚合酶的5'→3'外切核酸酶活性將探針降解，使得熒光基團與淬滅基團分離，即產生熒光信號。每經歷一個PCR反應循環，就有一分子的擴增產物生成，并伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團信號不斷積累，為一個指數同步增長的過程，熒光信號的強度就代表了擴增產物的拷貝數。該技術具有特異性強、自動化程度高等特點、有效解決了PCR污染等問題。