[發明專利]一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2及其表達方法

有效

• 申請號: 201611201987.9
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN107759677B
• 公開（公告）日: 2021-04-20
• 發明（設計）人: 耿福能;岳碧松;沈詠梅
• 申請（專利權）人: 四川好醫生攀西藥業有限責任公司
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;C12N15/12;C07K1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2及其表達方法：(1)通過提取美洲大蠊RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，獲得美洲大蠊過敏原蛋白編碼基因片段；(2)將過敏原基因克隆入原核表達載體中，構建重組表達質粒pET28a(+)?BA2，再轉入宿主菌大腸桿菌BL21，用IPTG誘導其表達，采用親和層析方法純化，從而獲得重組美洲大蠊過敏原蛋白BA2。通過藥理實驗顯示：BA2蛋白能明顯增加小鼠血清中的IgE含量(P0.05)，能顯著增加小鼠肺泡灌洗液和小鼠脾細胞上清液中IL?4、IL?5和IL?13炎癥因子的含量以及致使小鼠肺組織發生明顯病理變化。本發明所述方法能夠獲得純度較高的過敏原蛋白，為美洲大蠊過敏原后續研究以及其他動物體內潛在過敏原物質的研究提供參考依據。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2及其表達方法。

背景技術

變態反應疾病被世界衛生組織列為21世紀重點防治的三大疾病之一。變態反應疾病的發生極為廣泛，全世界有1/3的人口患有變態反應疾病。在變態反應疾病中，支氣管哮喘(簡稱哮喘)約占全部病例的1/4。哮喘可以由多種因素引發，其中過敏原，尤其是室內過敏原，具有十分重要的作用。室內過敏原主要包括動物皮屑、塵螨和蟑螂等。

蟑螂可以引起哮喘的報道最早出現在上世紀60年代。美洲大蠊是蟑螂過敏誘發哮喘的重要過敏源。蟑螂，即美洲大蠊(Periplaneta americana)，是我國南方室內蟑螂的優勢種群。國內外學者通過皮試和支氣管激發試驗測定，發現約40％的哮喘患者對蟑螂過敏原過敏，證實蟑螂是僅次于屋塵和塵螨的主要室內過敏原攜帶者，且蟑螂過敏原是一種強吸入性過敏原。蟑螂誘發哮喘的病原學研究是近年來過敏與哮喘研究領域的熱點。篩選新過敏原并對其過敏原性的研究對過敏性疾病的診斷和脫敏治療都具有重要意義。在診斷和治療蟑螂過敏性疾病時，廣泛使用的是過敏原的粗浸液，但由于其成分復雜，很難進行標準化且在治療中易導致免疫球蛋白(IgE)介導的其它過敏反應，因此限制了過敏原浸液在臨床上的使用。隨著基因工程技術的發展，重組蛋白逐漸被重視。與天然過敏原浸提液相比，重組過敏原的產量高，生產條件穩定，方便進行過敏原的標準化，利于臨床診斷和治療。近年來的研究證實重組蟑螂過敏原蛋白具有純度高、易于標準化的特點，能安全和有效地為患者提供免疫治療。與此同時，根據重組過敏原設計的疫苗被大量的運用到治療過敏性疾病中。開發能有效治療不同類型過敏癥的免疫治療疫苗已經成為新的研究熱點。

本發明擬通過PCR獲得過敏原基因，構建pET-28a(+)-BA2原核表達載體，并對其原核表達產物進行純化，獲得BA2蛋白質，同時對BA2蛋白誘發小鼠哮喘進行研究，為美洲大蠊的過敏原的研究以及其他動物體內潛在過敏原物質的研究提供參考依據。

發明內容

本發明的目的在于提供一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2及其表達方法，將PCR擴增得到的過敏原基因克隆入原核表達載體，構建重組表達質粒，再轉入宿主菌并誘導其表達，從而獲得過敏原蛋白BA2，本發明所獲得的過敏原蛋白作用于小鼠可誘發其過敏性哮喘。

本發明所述的一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2，其氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示。

進一步，所述過敏原蛋白BA2的氨基酸序列由質粒所表達的氨基酸序列和過敏原基因所表達的氨基酸序列組成，其中過敏原基因所表達的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本發明所述的一種美洲大蠊過敏原蛋白BA2的表達方法為：

a.從美洲大蠊組織中提取總RNA，反轉錄成cDNA；

b.以cDNA為模板進行PCR擴增反應，獲得美洲大蠊過敏原的編碼基因片段的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；

c.設計并合成酶切位點引物:

BA2-F 5’-CGGCTAGCATGACGATTGACTTCTACTACTT-3’