[發明專利]一種特異性抗Kif18A蛋白695位絲氨酸磷酸化抗體的制備方法與應用

在審

• 申請號: 201611181488.8
• 申請日: 2016-12-20
• 公開（公告）號: CN108203461A
• 公開（公告）日: 2018-06-26
• 發明（設計）人: 朱長軍;董智雄;姜偉
• 申請（專利權）人: 天津師范大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K16/18;G01N33/68;G01N33/574
• 代理公司: 天津創智天誠知識產權代理事務所(普通合伙) 12214
• 代理人: 王秀奎

1.一種Kif18A-S695磷酸化多肽，其特征在于：具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，其中第七位即第二個絲氨酸進行磷酸化。

2.一種Kif18A-S695磷酸化抗原，其特征在于：由Kif18A-S695磷酸化多肽與血藍蛋白KLH交聯制備形成，Kif18A-S695磷酸化多肽具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，其中第七位即第二個絲氨酸進行磷酸化。

3.根據權利要求2所述的一種Kif18A-S695磷酸化抗原，按照下列具體步驟進行：

(1)將G-25交聯葡聚糖800rpm,5min離心,棄上清，加入與葡聚糖等體積的PBS緩沖液混勻；

(2)向25ml玻璃瓶中加入134微升KLH，1866微升pH為6.0的PBS，最終KLH終濃度為10mg/ml；

(3)稱0.006g MBS，溶于200微升DMSO；

(4)在攪拌情況下，將步驟(3)的MBS分散體系緩慢加入到步驟(2)的KLH分散體系中，采用移液槍槍頭尖伸至液面以下的方式進行緩慢加入，持續攪拌30min；

(5)取一個25ml塑料移液管(作為層析柱)，用剪刀剪去上口，玻璃纖維堵住下口，將步驟(1)中G25交聯葡聚糖充分混勻倒入管子，純葡聚糖約5-6ml，使用50ml pH為7.4的PBS清洗蛋白親和層析柱；

(6)將步驟(4)中經攪拌分散均勻的KLH-MBS混合液加入步驟(5)準備的柱子；

(7)待KLH-MBS混合液全部進入柱子后，用pH 7.4PBS洗1次，同時開始用1.5ml的EP管在下面接液體，每管1ml，應用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，選濃度最高的3管液體進行混合，用于下述多肽交聯；

(8)將10mg多肽(SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：Cys-Ser-Val-Gln-Leu-Asn-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-Ile-Val-Tyr-Thr-Pro-Glu-Asp，其中第七位即第二個絲氨酸進行磷酸化)加入200微升pH 7.4PBS溶解，將溶解的多肽加入1.5ml經過步驟(7)得到的KLH混合物，攪拌1h；

(9)將經過步驟(8)交聯的物質用pH 7.4PBS透析12小時，每12h更換透析液(pH7.4PBS)，每次800ml；取出透析后的液體，加入pH 7.4PBS至總體積10ml，每管1ml分裝，-80度凍存。