[發明專利]一種能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母及其構建方法

有效

• 申請號: 201611176709.2
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106701606B
• 公開（公告）日: 2021-03-26
• 發明（設計）人: 劉澤寰;林蔣海;李帥
• 申請（專利權）人: 廣東利世康低碳科技有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/08;C12R1/72
• 代理公司: 廣州潤禾知識產權代理事務所(普通合伙) 44446
• 代理人: 周鄭奇;林名欽

1.一種能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母的構建方法，其特征在于，所述產朊假絲酵母為將 α-淀粉酶基因、糖化酶基因和酸性蛋白酶基因通過產朊假絲酵母多基因共表達載體整合至產朊假絲酵母基因組上構建而成；

α-淀粉酶和糖化酶為表面展示表達；酸性蛋白酶為分泌表達；

所述產朊假絲酵母多基因共表達載體為以釀酒酵母多基因共表達載體為基礎，去除釀酒酵母多基因共表達載體的 rDNA 序列，以產朊假絲酵母的甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子替換釀酒酵母多基因共表達載體的釀酒酵母磷酸甘油酸激酶啟動子而得；

所述產朊假絲酵母構建方法具體如下：

S1：使用限制性內切酶對產朊假絲酵母多基因共表達載體、釀酒酵母多基因共表達載體，以及 SEQ ID NO.1 所示的α-淀粉酶基因、SEQ ID NO.2 所示的糖化酶基因和 SEQ IDNO.3 所示的酸性蛋白酶基因進行雙酶切，純化回收所需片段；

S2：使用 DNA 連接酶將 α-淀粉酶基因和糖化酶基因分別連接入釀酒酵母多基因共表達載體，將酸性蛋白酶基因連入產朊假絲酵母多基因共表達載體， 形成三個重組單基因表達載體；

S3：使用限制性內切酶將含有載體啟動子和終止子片段的完整的 α-淀粉酶基因表達盒和糖化酶基因表達盒從重組單基因表達載體上切下，然后以串聯表達盒的形式逐個接入帶有酸性蛋白酶基因的單基因表達載體中，構建出 α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表達載體；

S4：使用限制性內切酶對上述構建的三基因共表達載體進行單酶切，使其線性化后將其轉入產朊假絲酵母，并整合到其基因組上，獲得能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母。

2.根據權利要求1所述的能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母的構建方法，其特征在于，步驟 S3 中，所述三基因共表達載體的構建包括如下步驟：

S11：使用限制性內切酶對 α-淀粉酶和糖化酶重組單基因表達載體進行雙酶切，回收帶有載體啟動子和終止子的α-淀粉酶和糖化酶基因的完整表達盒；

S12：使用限制性內切酶對酸性蛋白酶重組單基因表達載體進行酶切，然后將糖化酶基因表達盒連入酸性蛋白酶單基因表達載體，構建糖化酶和酸性蛋白酶二基因表達載體；

S13：使用限制性內切酶對步驟 S12 所構建的二基因表達載體進行酶切，然后將α-淀粉酶基因表達盒連入二基因表達載體，構建出 α-淀粉酶、糖化酶和酸性蛋白酶三基因共表達載體。

3.根據權利要求1所述的能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母的構建方法，其特征在于，步驟 S1 中所述的限制性內切酶為BamHI和SpeI；步驟S4中所述的限制性內切酶為SacI。

4.根據權利要求2所述的能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母的構建方法，其特征在于，步驟 S11 中所述的限制性內切酶為 NheI 和XbaI；所述步驟 S12 中所述限制性內切酶為 NheI；所述步驟 S13 中所述限制性內切酶為 NheI。

5.一種能降解利用餐廚廢棄物的基因工程產朊假絲酵母，其特征在于，采用權利要求1 至 4 任一項所述方法制備。