[發明專利]體外定量測定vWF-CP酶活性的方法、檢測試劑盒及制備方法

有效

• 申請號: 201611176211.6
• 申請日: 2016-12-19
• 公開（公告）號: CN106596936B
• 公開（公告）日: 2019-05-31
• 發明（設計）人: 林毅然;王季武;黃海燕
• 申請（專利權）人: 吳江華藥生物技術有限公司
• 主分類號: G01N33/573
• 分類號: G01N33/573;G01N33/558;G01N33/536
• 代理公司: 無錫互維知識產權代理有限公司 32236
• 代理人: 龐聰雅

本發明涉及體外定量測定vWF?CP酶活性的方法、檢測試劑盒及制備方法；方法包括試紙條制備、反應液制備、顯色反應、酶活性計算等步驟，檢測試劑盒包括試紙條、標準品1、標準品2、vWF?CP底物、工作液和終止液，試紙條上的金標抗體為膠體金標記的抗vWF?CP底物抗體，T線抗體為抗vWF?CP底物抗體，C線抗體為抗金標抗體抗體，金標抗體與T線抗體結合vWF?CP底物上不同的位點；標準品1和標準品2分別為高vWF?CP酶相對活性和低vWF?CP酶相對活性的制品；工作液為含二價金屬離子的緩沖液，終止液為含能絡合二價金屬離子的緩沖液；檢測試劑盒的制備方法包括試紙條制備、標準品制備、vWF?CP底物制備、工作液和終止液制備等步驟；本發明的方法、檢測試劑盒，檢測快捷、靈敏度高、準確性好。

技術領域

本發明涉及生物檢測領域，尤其涉及一種體外定量測定vWF-CP酶活性的方法、檢測試劑盒及制備方法。

背景技術

血栓性血小板減少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic Purpura，TTP)是一種嚴重的彌散性血栓性微血管病，以微血管病性溶血性貧血、血小板聚集消耗性減少，以及微血栓形成造成器官損害(如腎臟、中樞神經系統等)為特征。早期報道，TTP發病率為0.2～1/10萬，隨著臨床上對于此疾病的逐漸認知，近年來TTP的發病率有上升的趨勢。目前，國內尚未見到相關的流行病學統計。病人以女性為多，任何年齡均可發病，但最常見的發病年齡多為20～60歲，沒有地域或種族的差異。在臨床中具備典型“五聯征”(微血管病性溶血性貧血、血小板聚集消耗性減少、微血栓形成造成器官損害、神經系統異常和發熱)的患者，常因其表現的多樣性和非典型而導致誤診，TTP早期明確診斷并及時治療，病死率可從90％降為20％～30％，整體生存率提高為70％～85％。目前，血漿置換是TTP首選和有效的治療方法，并且發病后越早治療救活率越好。同時因為血漿置換的治療費用昂貴，血制品稀缺，并且有感染病毒性疾病和引起并發癥的風險，一旦誤診后果嚴重。因此是否能夠早期迅速診斷及應用血漿置換治療是影響TTP預后的重要因素。因此，TTP的早期發現至關重要。

目前對TTP的診斷主要依靠臨床表現，尚無特異的診斷性實驗室檢查，缺乏客觀性與可靠性。研究發現，血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)是一種大分子多聚體糖蛋白，在止血和血栓形成中起著重要作用。vWF多聚體的結構組成主要受血管性血友病因子裂解酶(von Willebrand factor cleaving protease,vWF-CP)調節，vWF-CP又名為ADAMTS-13(A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin 13repeatsfamily of metalloproteases)，正常人血漿中存在能夠裂解uL-vWF('unusually large'vWF)的蛋白酶。該酶在正常機體內可以特異性地裂解vWF的A2區的第1605位酪氨酸—1606位蛋氨酸(Y1605-M1606)之間的肽，從而使vWF裂解，保持正常的止血和血循環功能。當體內vWF-CP基因缺陷或者血漿中產生針對該酶的自身抗體時，vWF-CP的活性下降，uL-vWF在微血管中誘發血小板聚集形成微血栓，導致TTP的發生。臨床研究發現，正常人vWF-CP的活性水平下限大多大于正常人平均值的50％，上限因測量方法不同而有所區別。遺傳性TTP患者，其活性都低于正常活性的5％～10％，甚至幾乎為零。獲得性TTP患者大部分也有重度降低，僅少數患者只是輕度和中度下降。

判斷vWF-CP酶活性水平，對此類疾病的診斷和預后判斷具有重要價值。早期的檢測技術包括免疫放射測定、膠原結合法、瑞斯托霉素輔因子(vWF)，底物為全片段長vWF，多聚物，需要添加變性劑進行解折疊，但是人體內并無變性劑，不符合生理學條件，反應時間較長，16-48小時左右，時常導致病人因無法及時診斷、治療而喪失生命。