[發明專利]抗乙型肝炎病毒的遞送系統和生物制劑

在審

• 申請號: 201611170106.1
• 申請日: 2016-12-16
• 公開（公告）號: CN106729753A
• 公開（公告）日: 2017-05-31
• 發明（設計）人: 譚旭;董一洲;蔣超;梅淼;李斌
• 申請（專利權）人: 譚旭
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/69;A61K47/60;A61K47/26;C12N15/113;C12N15/88
• 代理公司: 北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙)11426
• 代理人: 汪送來

技術領域

本發明涉及醫藥領域，具體涉及抗乙型肝炎病毒領域，更具體涉及一種新型的抗乙型肝炎病毒的新型遞送系統和生物制劑。

背景技術

全球乙肝病毒感染者約有3.5億人，其中約1億人在中國。這些人由于乙肝病毒潛伏無法得到根治。乙肝病毒潛伏的主要原因是其基因組以一種共價閉環DNA(covalently closed circular DNA或cccDNA)的形式在病人的肝細胞核內長期穩定存在。現有的抗乙肝藥物主要是干擾素和核苷(酸)類似物，但這兩類藥物均無法清除cccDNA，因而無法根治乙肝。

新興的基因編輯技術CRISPR-Cas9系統由于其高效特異的DNA剪切和編輯能力而得到了在科研領域的廣泛應用。CRISPR-Cas9是在細菌中發現的一種DNA剪切系統，通過DNA內切酶Cas9在一段小RNA(guide RNA)的幫助下識別特定的DNA序列并在特定的位點進行剪切。由于需要同時表達一個大的蛋白Cas9和一個小的guide RNA，如何在人體進行安全有效的輸送有特異療效的CRISPR-Cas9系統是一個亟待解決的問題，并已經成為CRISPR-Cas9在臨床應用的瓶頸。

已有的CRISPR-Cas9體內輸送是通過運用腺病毒表達體系來表達Cas9和guide RNA，但是腺病毒的安全性仍有問題。而且，腺病毒在細胞內的長期穩定表達Cas9這種DNA酶，也有可能帶來長期的毒副作用?；谛滦偷闹|納米顆粒(LNP)的核酸輸送系統已經在活體內輸送小RNA比如siRNA和長鏈RNA比如mRNA上表現出良好的效果。

因此，對于安全有效的輸送有特異性療效的CRISPR-Cas9系統仍存在需要。

發明內容

本發明的目的在于提供一種高效的LNP遞送系統，通過將LNP與Cas9mRNA和一段單鏈guide RNA(sgRNA)通過微流裝置進行混合而得到，其能夠有效的被輸送到小鼠肝臟并對乙肝病毒cccDNA進行剪切，達到抑制乙肝病毒的目的。該試劑提供了一種在人體安全根治乙肝病毒的可能性。

本發明的第一個方面涉及靶向HBV基因保守區域的sgRNA分子，其具有SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:10所示的核酸序列之一：GAGGTGAAGCGAAGTGCACA(SEQ ID NO:1)；CCACCCAAGGCACAGCTTGG(SEQ ID NO:2)；CGGGGAGTCCGCGTAAAGAG(SEQ ID NO:3)；AAGCCACCCAAGGCACAGCT(SEQ ID NO:4)；GAAGCGAAGTGCACACGGTC(SEQ ID NO:5)；AGAAGATGAGGCATAGCAGC(SEQ ID NO:6)；CAAGCCTCCAAGCTGTGCCT(SEQ ID NO:7)；GGGGCGCACCTCTCTTTACG(SEQ ID NO:8)；GGACTTCTCTCAATTTTCTA(SEQ ID NO:9)；或TCCTCTGCCGATCCATACTG(SEQ ID NO:10)。

本發明的第二個方面涉及用于將基于CRISPR-Cas9系統的RNA分子運輸到肝臟的脂質納米顆粒。該脂質納米顆粒由脂多肽分子、二油?；字Ｒ掖及?、膽固醇和聚乙二醇構成。該脂質納米顆粒包裹Cas9mRNA和如上述第一個方面所述的sgRNA分子。

在本發明的一種實施方式中，該脂多肽分子為脂多肽的多聚體。在本發明的一種具體實施方式中，脂多肽為1,3,5-三(N¹,N³,N⁵-(3-雙十二烷氨基丙基)苯甲酰胺(TT3)，聚乙二醇為PEG2000。

在本發明的一種實施方式中，脂多肽分子、二油?；字Ｒ掖及?、膽固醇和聚乙二醇的摩爾比為15:25:45:0.75或15:30:40:0.75。Cas9mRNA和/或sgRNA與脂多肽分子的質量比范圍為(1:10)-(1:5)。在一種優選的實施方式中，Cas9mRNA和/或sgRNA與脂多肽分子的質量比范圍為1:10。

本發明的第三個方面涉及一種生物制劑，其包含本發明第二個方面所述脂質納米顆粒、Cas9mRNA和/或本發明第一個方面所述的sgRNA分子，以及藥學上可接受的賦形劑和輔料。

本發明的第四個方面涉及脂質納米顆粒的制備方法，該方法包括：

(i)將脂多肽分子、膽固醇和聚乙二醇溶于酒精中，得到第一溶液；并將Cas9mRNA和/或sgRNA分子溶于水，得到第二溶液；