[發明專利]可視化MTHFR等位基因分型檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201611163623.6
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106480220B
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 王建平;潘騰飛
• 申請（專利權）人: 廣州市寶創生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12Q1/6883
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 曾銀鳳,萬志香

技術領域

本發明屬于分子生物技術和基因檢測領域，具體是一種MTHFR等位基因(rs1801133和rs1801131)分型檢測試劑盒。

背景技術

亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)是甲硫氨酸-葉酸代謝系統中的關鍵酶，維持葉酸正常代謝。MTHFR等位基因位點rs1801133和rs1801131(c.677和c.1298位點)突變可導致其編碼的葉酸代謝關鍵酶活性降低，引起葉酸代謝障礙，造成葉酸水平降低及高同型半胱氨酸血癥。對于MTHFR基因異常的人，MTHFR酶活性明顯降低，造成葉酸代謝障礙，導致新生兒神經管缺陷、唐氏綜合癥及唇腭裂等疾病的發病風險明顯增高，這類人需要補充更多的葉酸才能達到預期的效果。

另外，亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)還參與同型半胱氨酸代謝過程，維持體內正常的同型半胱氨酸水平。研究發現，MTHFR基因c.677位點發生突變，會導致MTHFR的不穩定，致使酶活力的下降，最終致使血漿同型半胱氨酸水平的升高。同型半胱氨酸血癥有引起動脈粥樣硬化和血栓形成的危險，并最終可引起冠心病、腦梗死和外周血管病。中國人群中MTHFR C677T突變率高達25％，是中國H型高血壓與腦卒中高發的重要遺傳因素，因此，檢測MTHFR基因c.677位點還具有預測攜帶者患高血壓、腦卒中等疾病的作用。

目前市場上已有的MTHFR等位基因分型檢測試劑盒基本都是基于熒光信號檢測的PCR擴增技術，需要用到實時熒光PCR設備，其價格較為昂貴，不利于在設施條件差的醫療單位使用。而同時臨床中，至今為止尚未有能夠直接采用普通PCR循環儀器就能夠實現可視化分型MTHFR等位基因的閉管方法。

發明內容

基于此，本發明的目的為提供一種對設施條件要求低、結果判讀簡單、成本低廉的新型MTHFR等位基因分型檢測試劑盒,可實現分別針對MTHFR等位基因SNP位點位點1(rs1801133)野生型(P1)、位點1(rs1801133)突變型(P2)、位點2(rs1801131)野生型(P3)和位點2(rs1801131)突變型(P4)的分型檢測。

實現上述目的的技術方案如下。

一種可視化MTHFR等位基因分型檢測試劑盒，包括有4條引物，7條常規探針、以及2條與納米金顆粒連接的探針；

所述4條引物為：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述7條常規探針分別為SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11，或所述7條常規探針分別為SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.11的反向互補序列；

所述2條與納米金顆粒連接的探針的堿基組成如SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13所示，或SEQ ID NO.12至SEQ ID NO.13的反向互補序列所示。

本發明利用了基于納米金探針的可視化核酸檢測技術，在將高靈敏的PCR擴增方法、高特異的酶切方法及可視化的納米金探針檢測方法相結合，用于MTHFR等位基因分型的可視化檢測，實現低成本、高靈敏的MTHFR等位基因分型檢測。通過檢測攜帶者基因組DNA中的SNP位點(rs1801133和rs1801131)單核苷酸多態性位點，判定該攜帶者的MTHFR等位基因類型，并根據攜帶者的等位基因類型指導攜帶者服用葉酸劑量，或提醒攜帶者患高血壓、腦卒中等疾病的風險，從而起到預警作用，提高攜帶者的生活質量，為臨床和患者提供一種新型檢測方法。

本發明具有以下有益效果:

采用本發明中的試劑盒對MTHFR等位基因SNP位點進行分型檢測無需使用熒光探針，試劑存放無需避光，不必擔心熒光衰減的問題，因此存放條件更加穩定。

本發明采用的納米金探針有比較成熟的方法合成，成本低；具備高穩定性，能夠耐受強熱循環和強機械沖擊；具備強適用性，能夠與各種酶反應液共存而不影響反應的正常進行。

利用本發明中的試劑盒可實現短時間高靈敏度的閉管核酸檢測，能夠有效的避免擴增產物的交叉污染。

本發明中的試劑盒能夠采用普通PCR儀完成對MTHFR等位基因位點的分型檢測，且結果區分特征明顯。

附圖說明

下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，不用于限定有權利要求所界定的本發明范圍。

圖1是本發明中引物探針設計原理。

圖2是實施例2中檢測反應的靈敏度。

圖3是實施例3中匹配基因型檢測結果。

圖4是實施例4中干擾實驗檢測結果。

圖5是實施例5中代表性樣本檢測結果。