[發明專利]一種雜交瘤細胞株及其產生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體

有效

• 申請號: 201611157550.X
• 申請日: 2016-12-15
• 公開（公告）號: CN106701687B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發明（設計）人: 張金陽;胡娟;夏雪山;宋玉竹;韓芹芹;陳強
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/10;G01N33/577;G01N33/569;C12R1/91
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本發明提供了一種雜交瘤細胞株1A4，本發明提供的雜交瘤細胞株可以用于分泌制備高效識別狂犬病毒磷蛋白的單克隆抗體，小鼠腹水抗體采用間接酶聯免疫吸附分析法測得的效價為2×10⁵；單克隆抗體與狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原體無交叉反應，具有高特異性、高敏感性的優點，可以用于對狂犬病毒進行包括ELISA、Western?blot和免疫熒光在內的生物診斷具有良好的應用前景。

技術領域

本發明屬于細胞工程技術領域，具體涉及雜交瘤細胞株1A4及其產生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體。

背景技術

狂犬病是由狂犬病病毒引起的人獸共患病，發病死亡率幾乎100%，全世界每年有6萬人死于狂犬病，我國是狂犬病流行較為嚴重的國家之一。狂犬病是我國法定報告管理的乙類傳染病，其病原是狂犬病毒（Rabies virus）。磷蛋白在病毒逃逸、病毒轉錄復制以及細胞內運動中均發揮著一定的作用，還有可能作為病毒感染的臨床血清檢測抗原。雖然人源抗狂犬病毒藥近年來有了很大的發展，但是目前仍然沒有開發出非常有效的治療性藥物，因此，狂犬疫苗仍然是目前防治狂犬病的最有效的手段。

狂犬病毒基因組為不分節段的單股負鏈RNA，全長約12kb，分別編碼酶蛋白(L)、糖蛋白(G)、基質蛋白(M)、磷酸化蛋白(P)、核蛋白(N)五個主要結構蛋白。其中，G蛋白和N蛋白含有多個抗原位點，能夠誘導產生抗狂犬病毒抗體。磷蛋白屬于病毒RNA聚合酶的輔助因子，與病毒核蛋白和L蛋白構成的復合物緊緊將病毒基因組RNA包裹。磷蛋白是該蛋白復合體中的必要中介，一方面它介導L蛋白聚合酶在N-RNA模板中的正確定位，另一方面它發揮著分子伴侶的功能，形成復合體阻止其結合到細胞RNA上并便于其傳遞到病毒RNA包裝成為新的RNPs。磷蛋白是一種多功能蛋白，除了在病毒RNA合成中具有一定的功能外，還能夠與STAT1相互作用，并抑制干擾素信號轉導途徑，從而克服感染細胞的抗病毒反應，對抗宿主的先天免疫反應，是先天免疫反應的關鍵調控因子。磷蛋白在病毒逃逸、病毒轉錄復制以及細胞內運動中均發揮著一定的作用，還有可能作為病毒感染的臨床血清檢測抗原。

自1978年Wiktor和Koprowski首次制備了狂犬病病毒的單克隆抗體以來，越來越多的實驗室建立了狂犬病病毒的單克隆抗體雜交瘤細胞株。但主要集中于病毒核蛋白和糖蛋白上，且狂犬病毒檢測試劑盒僅限于檢測抗病毒糖蛋白和/或核蛋白抗體的間接ELISA檢測方法，在一定程度存在假陽性。而申請人在前期研究中證實在狂犬病毒減毒活疫苗免疫的小鼠中能夠與抗狂犬病毒核蛋白抗體一樣大量產生抗磷蛋白抗體，推測磷蛋白也可能是一種超抗原，具有一定的臨床診斷價值。競爭性ELISA可以有效降低間接ELISA中的非特異性反應。目前狂犬病毒抗體檢測試劑盒僅限于狂犬病毒核蛋白和糖蛋白的檢測，而基于磷蛋白單克隆抗體的狂犬病毒抗體檢測試劑盒尚未見報道。本發明提供的1A4單克隆抗體亞型為IgG1型，能用于競爭性ELISA、Western-blot和免疫熒光檢測，從而為基于該蛋白臨床檢測方法的建立及該蛋白功能的研究奠定堅實的基礎。

發明內容

本發明的目的是針對目前狂犬病嚴重危害人類健康，且防治過程中依然存在各種難處的現狀，而提供一種能與狂犬病病毒中的磷蛋白特異性結合的單克隆抗體以及產生該抗體的雜交瘤細胞。本發明的單克隆抗體雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體與狂犬病病毒的其他蛋白以及其他抗原和病原體無交叉反應，具有高特異性、高敏感性的優點，可以準確檢測狂犬病毒疫苗或感染組織中的磷蛋白成分的含量，具有良好的應用前景。

本發明的雜交瘤細胞株1A4已于2016年12年12日保藏于中國典型培養物保藏中心（CCTCC），保藏地址是：中國，武漢，武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：C2016194。

本發明另一目的是提供一種由上述雜交瘤細胞株1A4產生的狂犬病毒磷蛋白單克隆抗體，其輕鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQID NO：2所示。