[發明專利]一種中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法

在審

• 申請號: 201611152595.8
• 申請日: 2016-12-14
• 公開（公告）號: CN106834207A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 徐紅艷;朱新平;李偉
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司44104
• 代理人: 宣國華,劉艷麗

1.一種中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是包括以下步驟：

(1)選取性未成熟的雌鱉，經滅菌后取出離體卵巢組織，將離體卵巢組織用磷酸鹽緩沖液沖洗破碎后，置于容器中；

(2)采用膠原酶和胰酶對沖洗后的離體卵巢組織先后進行消化處理，然后離心收集細胞；

(3)將收集的細胞置于處理過的細胞培養容器中并加入完全培養基進行培養；

(4)待細胞增殖鋪滿細胞培養容器底部后，用胰酶消化傳代培養或冷凍保存，即獲得中華鱉卵巢細胞。

2.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(1)中選取性未成熟的1～2冬齡雌鱉。

3.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(1)中滅菌處理時采用體積百分含量為60～90％的酒精。

4.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(2)中所述膠原酶的濃度為0.5～2mg/mL，所述膠原酶購自sigma公司，消化時間為20～40min；所述胰酶的質量百分含量為0.01～0.5％，所述胰酶購自Invitrogen公司，消化時間為20～40min。

5.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(2)中消化處理完后用牛血清終止反應，再離心收集細胞。

6.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(3)中1L完全培養基中包括以下用量的成分：高糖DMEM 13～14g、pH值緩沖劑Hepes 4～5g、非必需氨基酸0.01～0.05mM、亞硒酸鈉1～2nM、丙酮酸鈉1～2mM、2-巰基乙醇200～300μM、抗生素penicillin/streptomycin 50～80μM、胎牛血清100～200mL、生長因子4～6納克。

7.根據權利要求1所述的中華鱉卵巢細胞分離及體外培養方法，其特征是：步驟(3)中所述細胞培養容器用質量百分含量為0.1～0.5％的明膠包被處理。