[發(fā)明專利]一種聚核苷酸、轉(zhuǎn)化子及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611147956.X
• 申請(qǐng)日: 2016-12-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108220289B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-09-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 龐振華;周豪宏;劉修才
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海凱賽生物技術(shù)股份有限公司;CIBT美國(guó)公司
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N1/21;C12N9/88;C12P13/00;C12R1/285;C12R1/01;C12R1/42
• 代理公司: 北京律智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11438
• 代理人: 王瑩;于寶慶

本發(fā)明涉及一種聚核苷酸，本發(fā)明還涉及一種含啟動(dòng)子及λ噬菌體阻遏蛋白CI的操縱位點(diǎn)的聚核苷酸、轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及該聚核苷酸、轉(zhuǎn)化子的應(yīng)用，特別是在發(fā)酵生產(chǎn)多肽，尤其是利用發(fā)酵生產(chǎn)的多肽產(chǎn)物生產(chǎn)1,5?戊二胺方面的應(yīng)用。一種第一聚核苷酸，所述第一聚核苷酸的序列為如SEQ ID NO 1所示的序列，或如SEQ ID NO 1所示序列的堿基互補(bǔ)序列。一種第二聚核苷酸，所述第二聚核苷酸包含一個(gè)啟動(dòng)子和如上所述的第一聚核苷酸。一種轉(zhuǎn)化子，所述轉(zhuǎn)化子包含如上所述的第二聚核苷酸。本發(fā)明解決了λP_R T?41C誘導(dǎo)條件下表達(dá)效果不好的技術(shù)問(wèn)題，為誘導(dǎo)重組表達(dá)提供了新的選擇。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種聚核苷酸，還涉及這種聚核苷酸作為λ噬菌體阻遏蛋白CI的操縱位點(diǎn)的應(yīng)用；本發(fā)明還涉及一種含啟動(dòng)子及λ噬菌體阻遏蛋白CI的操縱序列的聚核苷酸、轉(zhuǎn)化子，本發(fā)明還涉及該聚核苷酸、轉(zhuǎn)化子的應(yīng)用，特別是在發(fā)酵生產(chǎn)多肽，尤其是利用發(fā)酵生產(chǎn)的多肽產(chǎn)物生產(chǎn)1,5-戊二胺方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)

在以表達(dá)重組蛋白為目的的發(fā)酵中，通常使用組成型啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(又稱可誘導(dǎo)啟動(dòng)子)來(lái)啟動(dòng)重組基因的表達(dá)。組成型啟動(dòng)子的表達(dá)為持續(xù)性表達(dá)，無(wú)需調(diào)控。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子又分為阻遏型啟動(dòng)子和激活型啟動(dòng)子，分別受不同的轉(zhuǎn)錄因子(又稱轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白)控制。阻遏型啟動(dòng)子與阻遏蛋白(或稱轉(zhuǎn)錄抑制蛋白)結(jié)合，受到抑制；在誘導(dǎo)條件下，阻遏蛋白與啟動(dòng)子序列解離，解除抑制。對(duì)于阻遏型啟動(dòng)子而言，當(dāng)阻遏蛋白缺失時(shí)，可視為處于持續(xù)誘導(dǎo)狀態(tài)，也可當(dāng)成組成型啟動(dòng)子。例如Plac啟動(dòng)子受阻遏蛋白LacI抑制，是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。但lac啟動(dòng)子在不能表達(dá)LacI蛋白的宿主菌中可以組成型表達(dá)。激活型啟動(dòng)子在非誘導(dǎo)條件下不能表達(dá)或表達(dá)效率低；誘導(dǎo)條件下，激活蛋白被激活，并與激活型啟動(dòng)子結(jié)合，促使其表達(dá)。例如P_BAD啟動(dòng)子受激活蛋白AraC的激活。

原核生物的啟動(dòng)子中有兩個(gè)關(guān)鍵性元件，-10元件和-35元件，分別位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游約-35和-10堿基位置，是σ因子識(shí)別位點(diǎn)。σ因子是原核生物RNA聚合酶全酶(包括RNA聚合酶核心酶和σ因子)中的輔助因子。σ因子促使RNA聚合酶與啟動(dòng)子序列結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。

在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列中，序列上游，和/或序列下游有轉(zhuǎn)錄因子(阻遏蛋白或激活蛋白)的操縱位點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)與操縱位點(diǎn)的結(jié)合控制啟動(dòng)子。例如λ噬菌體基因組中含有6個(gè)λ噬菌體阻遏蛋白CI(簡(jiǎn)稱λCI)的操縱位點(diǎn)：OL1(TATCACCGCCAGTGGTA)，OL2(CAACACCGCCAGAGATA)，OL3(TATCACCGCAGATGGTT)，OR1(TACCTCTGGCGGTGATA)，OR2(TAACACCGTGCGTGTTG)，OR3(TATCACCGCAAGGGATA)。λ噬菌體中受λCI調(diào)控的L啟動(dòng)子(簡(jiǎn)稱λP_L)和R啟動(dòng)子(簡(jiǎn)稱λP_R)的-10元件和-35元件都分別與兩個(gè)λCI操縱位點(diǎn)部分重合，因此λCI與操縱位點(diǎn)的結(jié)合會(huì)阻礙RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄。λCI與各操縱位點(diǎn)的結(jié)合對(duì)啟動(dòng)子的活性都有一定的影響。對(duì)于λP_R來(lái)說(shuō)，當(dāng)OR1與OR2協(xié)同作用時(shí)，所起的抑制作用最大；OR1與OR3協(xié)同作用所起的抑制作用次之；而OR2與OR3協(xié)同作用或各操縱位點(diǎn)單獨(dú)作用所起的抑制作用更弱(見(jiàn)Lewis等，“New insights into the phage genentic switch:Effects of bacteriophage lambda operator mutations on DNA looping andregulation of P_R,P_L,and P_RM”，Journal of Molecular Biology(2016)，doi:10.1016/j.jmb.2016.08.027)。