[發明專利]熒光RT-RCR檢測河川沙塘鱧MyD88基因表達的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201611146087.9
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106591448B
• 公開（公告）日: 2020-03-31
• 發明（設計）人: 尹紹武;張宏葉;汪亞媛;趙誠
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/6888
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 黃欣

本發明公開了一種熒光RT?RCR檢測河川沙塘鱧MyD88基因表達的試劑盒及其應用。本發明中河川沙塘鱧MyD88基因實時熒光RT?PCR檢測方法的建立，為研究MyD88基因在河川沙塘鱧免疫體系中的進化地位及與疾病抗性的相關性，為進一步研究它們的生物學活性、功能和表達調控以及揭示河川沙塘鱧免疫抗感染機制奠定理論基礎。MyD88介導了絕大多數TLR信號傳導，在固有免疫反應中起著重要作用，MyD88基因的表達豐度在一定程度上反應了河川沙塘鱧的免疫系統活度，作為河川沙塘鱧疾病防治中的重要檢測指標，可以在魚體表現出疾病特征之前判斷魚體是否染病，以便提前采取有效的預防措施，防止出現因病害造成重大的經濟損失。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種熒光RT-RCR檢測河川沙塘鱧MyD88基因表達的試劑盒及其應用。

背景技術

魚類通過特異性免疫和非特異性免疫系統來抵御外來病原生物的侵害，機體的先天性免疫依賴有限的模式識別受體去識別病原體相關分子模式。目前被鑒定的模式識別受體主要有兩大類：胞質型模式識別受體(Cytosolic PRRs)和膜結合Toll樣受體(Membrane-bound Toll-like receptors,TLRs)。

Toll樣受體是研究最多的模式識別受體，其中MyD88介導了絕大多數TLR信號傳導(除TLR3外)，是最為重要的接頭分子之一，在先天免疫反應中起著重要作用。目前關于MyD88的研究主要集中在哺乳動物，關于魚類的研究結果較少，僅在斑馬魚、牙鲆、虹鱒、斜帶石斑魚、大西洋鮭、大黃魚等中有報道。

實時熒光定量PCR技術是在常規PCR技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。實時熒光PCR不僅實現了常規PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，實時熒光PCR技術具有靈敏度高、特異性高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優點，已廣泛應用于分子生物學和醫學研究等領域。隨著實時熒光PCR試劑盒的進一步開發，近年來，實時熒光PCR技術在動物疫病診斷中也得到了廣泛的應用。

河川沙塘鱧(Odontobutis potamophila)為我國特有的小型淡水底棲肉食性經濟魚類，在我國廣泛分布于長江中下游、錢塘江、閩江等水系。該魚為淡水底棲小型肉食性魚類，肉質細嫩，2011年作為上海世博會國宴招待貴賓用魚，號稱“世博第一魚”，近年來已越來越受到人們的喜愛，2012-2015年市場價已達到160元/公斤以上，具有較高開發價值，但是人工養殖時易發生細菌性、真菌性病害，導致嚴重的經濟損失。目前對河川沙塘鱧的研究主要集中在選育種和養殖等方面，對其免疫相關基因和抗病因子研究未見報道。因此，開展河川沙塘鱧的免疫相關基因(因子)研究，初步了解其免疫應答機制，對河川沙塘鱧病害防治和開辟河川沙塘鱧抗病育種新途徑具有重要意義。

發明內容

解決的技術問題：本發明的目的是提供一種熒光RT-RCR檢測河川沙塘鱧MyD88基因表達的試劑盒及其應用，為研究MyD88基因在河川沙塘鱧免疫體系中的進化地位及與疾病抗性的相關性，為進一步研究它們的生物學活性、功能和表達調控以及揭示河川沙塘鱧免疫抗感染機制奠定理論基礎。

技術方案：一種熒光RT-RCR檢測河川沙塘鱧MyD88基因表達的試劑盒，包括MyD88基因特異引物對、內參基因β-actin引物對和PCR反應試劑，其中，

MyD88基因特異性引物對序列為：

MyD88-F：5’-TCCAAGGGTATCCCAACCCTC-3’(SEQIDNO.1)

MyD88-R：5’-CGTGGAGGACCTTCGTGCTT-3’(SEQIDNO.2)

內參基因β-actin引物對序列為：：

β-actinF：5’-TGGACTTCGAGCAGGAGATGAG-3’(SEQIDNO.3)