[發(fā)明專利]一種采用連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離核苷酸的工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611142887.3
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106632519B
• 公開（公告）日: 2020-02-21
• 發(fā)明（設計）人: 應漢杰;王瑩瑩;吳菁嵐;焦朋飛;周精衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學
• 主分類號: C07H1/06
• 分類號: C07H1/06;C07H19/10;C07H19/20
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 胡建華

1.一種采用連續(xù)離子交換色譜技術(shù)分離核苷酸的工藝，其特征在于，RNA酶解液經(jīng)脫色預處理后，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸UMP、GMP、CMP和AMP；

其中，采用三區(qū)式兩步驟的連續(xù)離子交換色譜分離四種5’-核苷酸為利用12根裝有凝膠型強酸性陽離子交換樹脂柱的連續(xù)分離裝置分離四種5’-核苷酸；

包括循環(huán)操作的兩個步驟：

步驟1：

樹脂柱分為吸附區(qū)、解吸區(qū)和再生區(qū)三個區(qū)，其中，吸附區(qū)為1根樹脂柱，解吸區(qū)為5根樹脂柱，再生區(qū)為6根樹脂柱；

吸附區(qū)：按0.042g5’-核苷酸/g濕樹脂的上樣量吸附預處理后的酶解液，酶解液濃度：尿嘧啶核苷酸4g/L，胞嘧啶核苷酸6g/L，鳥嘌呤核苷酸10g/L，腺嘌呤核苷酸11g/L，上樣時間為2h，上樣流速為0.52BV/h；此時大部分UMP不與樹脂發(fā)生離子交換流出，其余幾種核苷酸與樹脂發(fā)生離子交換并吸附至樹脂中，吸附完成后，用水洗脫樹脂柱，洗脫流速為1.65BV/h，水洗脫初期樹脂間隙中剩余UMP被快速洗出，隨后部分GMP也被洗出同時與UMP完全分離，洗脫出來的GMP的量為540mL水洗脫過程持續(xù)到CMP即將流出為止；

解吸區(qū)：5根樹脂柱串聯(lián)，用0.2mol/L氫氧化鈉溶液洗脫，洗脫流速為3.9mL/min在倒數(shù)第二根樹脂柱出口處安裝三通閥，使得倒數(shù)第二根樹脂柱流出液中一半流出收集AMP，另外一半流入最后一根樹脂柱，最后一根樹脂柱出口收集CMP；

再生區(qū)：6根樹脂柱左邊兩根樹脂柱串聯(lián)設置，第三根樹脂柱獨立設置，第四根和第五根樹脂柱串聯(lián)，最后一根獨立設置，從左往右分別泵入再生劑水、酸、水、堿進行再生，即：使用1.2mol/L氫氧化鈉對再生區(qū)中最右邊一根樹脂柱進行雜質(zhì)的去除，流量1.3BV/h，使用純水以0.75BV/h流量將再生區(qū)中第四根和第五根樹脂柱中氫氧化鈉沖洗干凈至流出液pH為9.5，使用1.2mol/L的鹽酸將再生區(qū)中第三根樹脂轉(zhuǎn)化為氫離子型，流量1.3BV/h，使用純水以0.75BV/h流量將再生區(qū)中第一根和第二根樹脂柱中樹脂間隙里的鹽酸沖洗干凈至流出液pH為4，再生完全；

步驟2：

12根樹脂柱分為解吸區(qū)和再生區(qū)兩個區(qū)，其中，解吸區(qū)為6根樹脂柱，再生區(qū)為6根樹脂柱；

步驟1中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中吸附區(qū)的樹脂柱之后與其串聯(lián)，形成步驟2中的解吸區(qū)的第一部分；步驟1中解吸區(qū)的第一根樹脂柱同時切換到步驟1中的再生區(qū)，作為步驟2中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟1中解析區(qū)的第二根及與其串聯(lián)的之后的樹脂柱依舊保持串聯(lián)，作為步驟2中解吸區(qū)的第二部分；步驟2中解析區(qū)的第一部分和第二部分獨立處理；

解吸區(qū)：

第一部分，通入水洗脫，將步驟1中未洗脫完全的剩余GMP完全洗出，通入水洗脫至兩根樹脂柱中的第一根樹脂柱內(nèi)完全為AMP，第二根樹脂柱中完全是CMP，洗脫流速為3.6mL/min；

第二部分，通入0.2mol/L的氫氧化鈉水溶液洗脫至前一根樹脂柱中無AMP流出，并且在最后一根樹脂柱出口收集AMP，體積為800mL；

再生區(qū)：同步驟1中再生區(qū)的操作；

將步驟2中解吸區(qū)第二部分第一根樹脂柱切換至步驟2中的再生區(qū)作為步驟1中再生區(qū)的第一根樹脂柱；步驟2中再生區(qū)的最后一根樹脂柱切換到步驟1中的吸附區(qū)；步驟2中解吸區(qū)第二部分的第二根樹脂柱與解吸區(qū)第一部分的樹脂柱串聯(lián)，作為步驟1中的解吸區(qū)；

循環(huán)進行步驟1和步驟2；保證所有樹脂柱同步切換，同時再生區(qū)按照堿-水-酸-水的方向進行切換； 樹脂柱切換時間優(yōu)選為240min；

通過該連續(xù)離子交換色譜工藝實現(xiàn)了四種5’-核苷酸的連續(xù)分離，四種核苷酸也實現(xiàn)完全分離，并且經(jīng)過六次切換之后得到四種核苷酸產(chǎn)物，分別是：尿苷酸、鳥苷酸、胞苷酸和腺苷酸。