[發(fā)明專利]雷公藤焦磷酸合酶TwCPS4及其制備松香烷型二萜化合物的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611142858.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-12
• 公開（公告）號(hào): CN107058274B
• 公開（公告）日: 2018-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 高偉;黃璐琦;蘇平;周家偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/90
• 分類號(hào): C12N9/90;C12N15/61;C12P15/00;C12P17/18;C12P17/04
• 代理公司: 北京鼎承知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司11551
• 代理人: 張波濤,管瑩

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及通過基因工程方法獲得二萜類化合物合成的關(guān)鍵酶，特別涉及雷公藤二萜合酶及其在松香烷型二萜化合物制備中的用途。

背景技術(shù)

藥用植物雷公藤(Tripterygium wilfordii.Hook.f.)是一味中草藥，

被廣泛用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和炎癥的治療(Raphaela G M，Mildred W，Roy F，et al.Comparison of Tripterygium wilfordii Hook F Versus Sulfasalazine in the Treatment of Rheumatoid Arthritis：A Randomized Trial[J].Annals of Internal Medicine，2009，151(4)：229-240.Tao X L，Lipsky P E.The Chinese anti-inflammatory and immunosuppressive herbal remedy Tripterygium wilfordii Hook F.[J].Rheumatic Disease Clinics of North America，2000，26(1)：29-50.)。萜類成分為雷公藤的主要活性成分，包括雷公藤甲素(triptolide)、雷酚內(nèi)酯(triptophenolide)和雷公藤紅素(celastrol)等。從中藥中的活性成分開發(fā)新藥是一種很有潛力的方式，然而由于植物的生長(zhǎng)緩慢，再加上這些有效成分在植物體中的含量不多，因而大大限制了它的發(fā)展。通過探尋和闡釋萜類成分在雷公藤中的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，有助于為藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應(yīng)用空間。

二萜類化合物通常以GGPP為底物，在二萜合酶復(fù)合體的催化作用下形成，即IPP通過一系列的反應(yīng)形成GGPP后，二萜合酶復(fù)合體以GGPP為起始底物，經(jīng)過最初的離子異構(gòu)化后環(huán)化形成各種陽離子中間產(chǎn)物，最終通過去質(zhì)子或捕獲親核物質(zhì)進(jìn)一步環(huán)化形成一系列的二萜骨架中間體；并通過細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)修飾，主要包括羥基化、甲基化、異構(gòu)化、脫甲基化、加成和還原等，最終生成二萜類化合物。

雷公藤中二萜類化合物結(jié)構(gòu)復(fù)雜、種類繁多，合成代謝途徑尚不完全清楚。目前基于基因組序列分析和表達(dá)序列標(biāo)簽分析，對(duì)雷公藤二萜合酶復(fù)合體中的部分酶活性蛋白進(jìn)行了初步預(yù)測(cè)，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足雷公藤二萜化合物生物合成的需求，不能解釋雷公藤二萜化合物種類的多樣性，更不能確定預(yù)測(cè)的酶活性蛋白具體導(dǎo)致了何種二萜類產(chǎn)物，因此迫切需要挖掘雷公藤二萜合酶復(fù)合體中新的酶活蛋白，并確定其具體的催化功能。

雷公藤甲素具有抗腫瘤、抗炎、抗排異、抗生育等藥理作用，雷公藤甲素與丹參酮類化合物同屬松香烷型二萜。酶催化制備丹參酮的方法已有報(bào)道，但酶催化制備雷公藤甲素尚未獲得成功。針對(duì)雷公藤甲素、丹參酮共同的松香烷型二萜化合物前體進(jìn)行研究能夠?yàn)樽罱K酶催化法合成雷公藤甲素打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明人團(tuán)隊(duì)在對(duì)雷公藤二萜合酶復(fù)合體中的酶活蛋白進(jìn)行研究過程中，意外的發(fā)現(xiàn)了一種與TwCPS1序列相似的柯巴基焦磷酸合酶。最初認(rèn)為其是TwCPS1的天然突變等效物，隨后進(jìn)一步的研究表明其與TwCPS1同時(shí)穩(wěn)定存在于同一株雷公藤懸浮細(xì)胞中，并且二者在經(jīng)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)時(shí)的過表達(dá)情況也不同。新發(fā)現(xiàn)的柯巴基焦磷酸合酶對(duì)誘導(dǎo)的反應(yīng)更快，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)初期松香烷型二萜化合物的合成和累積，而TwCPS1對(duì)誘導(dǎo)的反應(yīng)滯后，負(fù)責(zé)誘導(dǎo)中后期松香烷型二萜化合物的合成和累積，因此將這種新的柯巴基焦磷酸合酶命名為TwCPS4。

將克隆得到的雷公藤柯巴基焦磷酸合酶基因Twcps4和丹參中的Smksl1基因分別構(gòu)建表達(dá)載體，成功生成了次丹參酮二烯。進(jìn)一步證實(shí)了TwCPS4在合成雷公藤甲素等松香烷型二萜合成中的作用，且提供了一種合成松香烷型二萜前體的方法，為雷公藤甲素的生物合成奠定基礎(chǔ)。