[發明專利]一株重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用

有效

• 申請號: 201611142783.2
• 申請日: 2016-12-13
• 公開（公告）號: CN106754595B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 李艷;周芳芳;陳可泉;嚴明;郝寧;歐陽平凱
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P19/56;C12R1/19
• 代理公司: 南京匯恒知識產權代理事務所(普通合伙) 32282
• 代理人: 王月霞

本發明公開了一株重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用，所述重組菌中同時含有番茄來源糖基轉移酶UGTSL2基因和馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因，將番茄來源糖基轉移酶UGTSL2基因克隆到pRSFDuet?1的NdeI與XhoI位點之間，構建得到重組質粒pRSFDuet?SL2，然后再將馬鈴薯來源蔗糖合酶StSUS1基因克隆到pRSFDuet?SL2的NcoI和EcoRI位點之間，構建得到重組質粒pRSFDuet?SL2?SUS1，將重組質粒pRSFDuet?SL2?SUS1轉化到宿主細胞中，得到重組菌。將重組菌誘導表達后取粗酶液，加入到反應混合物中催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D，反應中使用重組菌破碎后的粗酶液，避免了酶的分離純化，也無需制作凍干粉，反應液中不需添加UDP或UDP?葡萄糖和任何細胞通透劑或其他化學試劑，環境友好性更佳。萊鮑迪甙D的產率高達10.8 g/L。

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種重組菌及其在催化萊鮑迪甙A生成萊鮑迪甙D中的應用。

背景技術

隨著人們對健康的關注意識日益提高，消費者對蔗糖的攝入量逐漸減少，食品工業致力于發展低熱值高甜度的天然甜味劑。甜菊糖提取自原產于南美巴拉圭和巴西的多年生菊科草本植物甜葉菊，具有高甜度（為蔗糖的250～300倍）、低熱量（僅為蔗糖的1/300）的特性，無毒副作用，無致癌物，食用安全，對高血壓、糖尿病、肥胖癥、心臟病、齲齒等病癥還有一定的藥理作用和輔助療效。它是繼甘蔗糖、甜菜糖之外的第三種有開發價值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被國際上譽為“世界第三糖源”。1998年，美國食品和藥物管理局（FDA）同意將甜菊糖添加到食品飲料中。瑞士將甜菊糖列入本國藥典作為糖漿劑、口服液或含片的主要甜味劑原料,取代了糖精鈉等傳統藥用甜味劑。相對于日本、美國和瑞士，歐盟批準使用甜菊糖的時間稍晚一些。2008年歐盟正式批準其作為食品添加劑。

由于對甜菊糖的需求量不斷增加，許多國家包括日本、新加坡、馬來西亞、韓國、中國、以色列、印度、巴西和澳大利亞等都已在商業化種植甜葉菊。甜葉菊的葉子含有多種天然的甜味糖甙如甜菊甙、萊鮑迪A-F、杜爾可甙A和甜茶甙。其中，萊鮑迪甙D雖然不是甜菊糖總甙中的主要糖甙，但其后苦味顯著低于萊鮑迪甙A（Chemosens Percept. 6(3): 109–117）。2008年，美國FDA簽發了確認萊鮑迪甙A能以最低95%的純度用作零卡路里甜味劑的“通常認為是安全的”（“GRAS”）通知。萊鮑迪甙D與萊鮑迪甙A結構相似，只相差一個葡萄糖基，甜菊糖苷相關的結構物質的毒性研究也證實萊鮑迪甙D食用安全，可用于食品藥品等領域(Int. J. Toxicol. , 2013,32(4):261-273.)。因此，萊鮑迪甙D是比萊鮑迪甙A具有更好味質的潛在天然甜味劑。

植物來源的UDP-糖基轉移酶能催化萊鮑迪甙A糖基化生成萊鮑迪甙D，如UGT91D2(US2014/0357588A1)、EUGT11(WO/2013/022989A2)和UGTSL2（US2014/0357588A1,Biomolecules 2014,4:374-389)等。糖基轉移酶由于UDP-糖基轉移酶所催化的轉糖基反應中需要活化的糖基供體UDP-葡萄糖，為了降低成本，通常會采用再生UDP-葡萄糖再生體系，如在體系在加入UDP和蔗糖，在蔗糖合酶的作用下生成UDP-葡萄糖和果糖（Biotechnol.Adv.2016,34(2):88-111.）。專利CN201310353500.9和CN201410019981.4 在以萊鮑迪甙A為底物制備萊鮑迪甙M過程中萊鮑迪甙D為其中間產物或直接用作制備萊鮑迪甙M的底物。反應體系中使用重組細胞，需要添加甲苯或其它細胞通透劑；或使用重組細胞凍干粉，而凍干粉的制備耗能、成本高；此外都需要額外添加UDP作為UDP-葡萄糖再生體系的輔底物。專利CN201410019981.4中雖然對CN201310353500.9的工藝進行了優化、但還需要調配UDP-糖基轉移酶和蔗糖合酶的添加比例，重組菌用量大，產酶成本高。

發明內容