[發明專利]一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法

在審

• 申請號: 201611140272.7
• 申請日: 2010-06-22
• 公開（公告）號: CN106645716A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;喬榮岑
• 申請（專利權）人: 普萊柯生物工程股份有限公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙)11017
• 代理人: 韓登營

本申請為專利申請201010210104.7的分案申請，原案申請日為2010年6月22日，原案發明名稱為“一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法”。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別是一種豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法。

背景技術

豬圓環病毒2型(porcine cirovirus type 2,PCV2)是引起仔豬斷奶多系統衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)的主要病原。自1991年在加拿大豬群中暴發以來，PMWS已經波及全球，給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。PCV2還與增生性壞死性肺炎、母豬繁殖障礙、豬皮炎與腎病綜合征和豬呼吸道疾病綜合征相關。豬圓環病毒相關疾病(PCV2Associated Disease，PCVD)，主要是PMWS，在2005年給歐洲造成的損失高達6億歐元。PCV2感染性疾病引起死亡率增高、飼料報酬降低，加上我國規模化豬場飼養管理水平相對較為落后，因此PCVD也給我國的養豬業造成了巨大的經濟損失。

目前，國際上上市的PCV2疫苗分為滅活疫苗、亞單位疫苗和嵌合滅活苗。PCV2疫苗效力檢驗方法通常是采用仔豬攻毒實驗的方法。而我國豬群PCV2污染嚴重，對于篩選出合格的用于PCV2疫苗開發或者疫苗效力檢驗的實驗豬比較困難，而且仔豬攻毒實驗方法存在費時、費力、費錢及PCV2攻毒模型建立困難、檢驗結果批間差異大等問題。

發明內容

鑒于此，本發明通過豬圓環病毒2型疫苗免疫小白鼠，測定其血清中PCV2特異性抗體水平，提供了一種簡捷有效的PCV2疫苗效力檢驗方法。包括下述步驟：

1.小白鼠的免疫

將豬圓環病毒2型疫苗經皮下免疫小白鼠，10-21天后再按照相同的免疫途徑和劑量進行加強免疫一次；

2小白鼠抗體水平的測定

加強免疫14-28天后，處死小白鼠，采集并分離血清，測定抗體水平；

本發明所述的豬圓環病毒2型滅活疫苗效力的檢驗方法中，所述小白鼠的免疫劑量為0.1-0.2ml，并且分4點免疫。

本發明所述的豬圓環病毒2型疫苗效力檢驗方法中，所述小白鼠抗體水平的測定方法包括如下操作步驟，

①將待檢血清用PBS做倍比稀釋；

②加入已經包被PCV2Cap蛋白的ELISA酶標板中；

③放入37℃溫箱，作用1h；

④棄去一抗，PBST洗滌；

⑤加入PBS稀釋的HRP標記羊抗鼠IgG(二抗)，放入37℃溫箱，作用1h；

⑥棄去二抗，用PBST洗滌；

⑦加入顯色液進行顯色；

⑧加入終止液終止顯色；

⑨酶標儀讀取OD₄₅₀，判定疫苗效力；

所述稀釋液、洗滌液、顯色液、終止液均為現有技術的常規用液。

最優地，本發明所述的首次免疫小白鼠的時間為14天。

最優地，本發明所述的加強免疫小白鼠的時間為21天。

本發明具有如下技術效果：

1.檢測時間短，比豬體內效力檢驗的時間至少減少20天；

2.本發明方法操作簡單，可重復性好，結果準確。

3.小白鼠遺傳穩定，不會出現實驗動物個體差異而引起的實驗結果差異顯著；

4.用疫苗免疫小白鼠操作簡單，同時不需要買大量的實驗豬，大大節約了成本、人力，提高了疫苗檢測的效率。

具體實施方式

本發明的實施例中利用平行實驗的方法建立了免疫小白鼠抗體水平、免疫豬抗體水平及仔豬攻毒保護的關系，發現免疫小白鼠抗體水平與免疫后豬的抗體水平及攻毒后淋巴結感染存在平行關系。應用本發明的方法，可以替代通常采用的PCV2疫苗免疫豬抗體水平實驗以及仔豬攻毒保護實驗。本發明實施例中還利用本發明檢測方法制定出PCV2疫苗效力的合格標準，為PCV2疫苗的大規模生產和檢測提供了基礎。

實施例1

豬圓環病毒2型滅活疫苗效力的檢測

1.滅活疫苗來源

PCV2滅活疫苗的毒株為PCV2-SH株(保藏號CGMCC No.2389)。將PCV2-SH株接種PK15細胞，5天后收獲病毒抗原液做為滅活疫苗。