[發明專利]一種利用桃膠凝膠板電泳完成古代絲織品測定的方法

有效

• 申請號: 201611138143.4
• 申請日: 2016-12-12
• 公開（公告）號: CN106596690B
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 彭志勤;古錦翠;王秉;萬軍民;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

1.一種利用桃膠凝膠板電泳完成古代絲織品測定的方法，其特征在于該方法采用步驟如下：

a)將采摘的干燥桃膠固體20～50g溶脹在水中，重復過濾直到液體澄清，加入鹽酸使其可以完全浸泡桃膠，控制水解溫度80～100℃，水解時間0.5～1h，制得桃膠多糖；

b)向桃膠多糖中加入質量分數為20～30％的H₂O₂溶液200～400mL對桃膠進行脫色處理，然后用截留分子量為3500～4000透析袋透析進行脫鹽處理，透析24～30h后使用聚乙二醇6000進行濃縮，放入100～300mL質量分數為0.5～1.5％的SDS溶液中浸泡6～8h；

c)在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板，制得桃膠凝膠板備電泳操作使用；

d)稱取一份古代絲織品，以1:100的浴比在質量分數為0.5％的Na₂CO₃水溶液和質量分數為0.5～1.5％的SDS混合溶液中沸煮30min進行脫膠，共脫膠兩次，1h之后，將溶液和絲素分離，絲素用去離子水沖洗并在50～60℃的烘箱中烘干備用；

e)將脫膠烘干的絲素纖維放入預先配好的CaCl₂:H₂O:ethanol體積比為1:8:2的混合溶液中，浴比為1：25，加熱到90～95℃蒸煮10～20min，獲得蠶絲溶液，冷卻過濾之后用截留分子量為8000～14000的透析袋透析，并每隔3～4h換一次水，70～72h后得到絲素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000濃縮至原體積的1/3～2/3；

f)通過重泡漲上樣法將步驟e)得到的樣品用pH范圍為3.0～5.3的IPG膠條覆蓋，使用液體石蠟密封之后等電聚焦，加入質量分數為1.5～2％的二硫蘇糖醇溶液2～3mL和質量分數為2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5mL平衡15～20min，進行桃膠凝膠電泳，使用質量分數為0.25％的卡馬斯亮藍，質量分數為50％的乙醇，質量分數為10％的乙酸對膠條染色，觀察三組樣品的電泳圖像；

g)將經步驟f)染色樣品的電泳條帶割下來分別裝入1.5mL離心管中，加入300～400μL水震蕩洗滌，重復一次后加入乙腈與碳酸氫銨溶液1:1混合的脫色液40～70μL，2～4min之后用去離子水終止反應并重復洗滌一次，吸出多余的液體，然后將裝有膠粒的離心管開蓋置于真空濃縮儀中干燥；

h)向步驟g)所得的樣品離心管中加入50～80μL的胰凝乳蛋白酶溶液，完全蓋住膠粒冰浴40～50min使膠粒充分吸收酶解液溶脹然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h進行膠內酶解；

i)采用HPLC-MS/MS對其進行質譜分析，根據質譜檢測得到的氨基酸序列與氨基酸序列數據庫對比得到古代絲織品的蠶絲種類。

2.一種利用桃膠凝膠板電泳完成古代絲織品測定的方法，其特征在于該方法采用步驟如下：

a)將采摘的干燥桃膠固體35g溶脹在水中，重復過濾直到液體澄清，加入鹽酸使其可以完全浸泡桃膠，控制水解溫度90℃，水解時間0.75h，制得桃膠多糖；

b)向桃膠多糖中加入質量分數為25％的H₂O₂溶液300mL對桃膠進行脫色處理，然后用截留分子量為3750透析袋透析進行脫鹽處理，透析27h后使用聚乙二醇6000進行濃縮，放入200mL質量分數為1％的SDS溶液中浸泡7h；

c)在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片，放上制膠架，擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板，制得桃膠凝膠板備電泳操作使用；

d)稱取一份古代絲織品，以1:100的浴比在質量分數為0.5％的Na₂CO₃水溶液和質量分數為1％的SDS混合溶液中沸煮30min進行脫膠，共脫膠兩次，1h之后，將溶液和絲素分離，絲素用去離子水沖洗并在55℃的烘箱中烘干備用；

e)將脫膠烘干的絲素纖維放入預先配好的CaCl₂:H₂O:ethanol體積比為1:8:2的混合溶液中，浴比為1：25，加熱到93℃蒸煮15min，獲得蠶絲溶液，冷卻過濾之后用截留分子量為11000的透析袋透析，并每隔3.5h換一次水，71h后得到絲素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000濃縮至原體積的1/2；

f)通過重泡漲上樣法將步驟e)得到的樣品用pH范圍為4.2的IPG膠條覆蓋，使用液體石蠟密封之后等電聚焦，加入質量分數為1.75％的二硫蘇糖醇溶液2.5mL和質量分數為2.5％的碘乙酰胺溶液4.5mL平衡17.5min，進行桃膠凝膠電泳，使用質量分數為0.25％的卡馬斯亮藍，質量分數為50％的乙醇，質量分數為10％的乙酸對膠條染色，觀察三組樣品的電泳圖像；

g)將經步驟f)染色樣品的電泳條帶割下來分別裝入1.5mL離心管中，加入350μL水震蕩洗滌，重復一次后加入乙腈與碳酸氫銨溶液1:1混合的脫色液55μL，3min之后用去離子水終止反應并重復洗滌一次，吸出多余的液體，然后將裝有膠粒的離心管開蓋置于真空濃縮儀中干燥；

h)向步驟g)所得的樣品離心管中加入65μL的胰凝乳蛋白酶溶液，完全蓋住膠粒冰浴45min使膠粒充分吸收酶解液溶脹然后置于30℃烘箱中孵育11h進行膠內酶解；

i)采用HPLC-MS/MS對其進行質譜分析，根據質譜檢測得到的氨基酸序列與氨基酸序列數據庫對比得到古代絲織品的蠶絲種類。