[發明專利]一種藥用級重組人激肽原酶產業化生產方法

有效

• 申請號: 201611128101.2
• 申請日: 2016-12-09
• 公開（公告）號: CN106929496B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 馬永;王安良;范宇
• 申請（專利權）人: 江蘇眾紅生物工程創藥研究院有限公司
• 主分類號: C12N9/64
• 分類號: C12N9/64;C12R1/84
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種表達重組人激肽原酶?1的重組菌株及其發酵和純化工藝，以及一種針對上述重組菌株優化的BSM發酵培養基。本發明的發酵工藝誘導劑甲醇的添加量較低，發酵液中目的蛋白產量高且易于純化，獲得的激肽原酶主要是低糖基化產物，免疫原性低并便于藥物質量控制；與已有激肽原酶發酵技術相比，克服了發酵體系中甲醇加入量過大，制備的激肽原酶活性較低，糖基化修飾較高等缺陷。除此之外，與現有激肽原酶發酵技術相比，發酵時間明顯縮短，有效降低了生產成本，活性、產量均有50％以上的提高。

技術領域

本發明屬于微生物領域，涉及一種重組人激肽原酶-1(Recombinant humanKallikrein-1，以下簡稱rhKLK1)基因的重組菌株及其生產和純化工藝。

背景技術

激肽釋放酶－激肽系統(kallikreinkinin system，KKS)又稱激肽系統，廣泛存在于動物體內的多個系統，尤其是在心血管系統內分布更為密集。其主要成分為：激肽原(活性因子前體)、激肽原酶(活性因子前體的激活物，又稱為激肽釋放酶)、激肽(主要活性因子)、激肽酶(活性因子的滅活物)。正常情況下激肽生成后迅速被循環中的激肽酶滅活。

激肽原酶，又稱激肽釋放酶，是一種絲氨酸蛋白酶，能使激肽原釋放出激肽，它具有很高的生理活性，在人體組織中起著十分重要的生理作用。目前分為兩類：血漿激肽原酶(PK)和組織激肽原酶(TK)。兩種酶在分子量大小、底物特異性、免疫學特征和釋放出的激肽方面都不同。血漿激肽原酶參與血凝塊的表面激活、纖維蛋白溶解、激肽生成和炎癥過程。組織激肽原酶廣泛存在于腎、胰腺、胃腸道黏膜及中樞神經系統等許多組織中，它以激肽原酶原的形式在組織中合成，再經胰蛋白酶激活形成組織激肽原酶，并可釋放至血液循環。組織激肽原酶基因是一類大的多基因家族，目前證明人組織激肽原酶基因家族至少由15個基因(KLK1-KLK15)組成。共分為五個亞系：第一組KLK4、KLK5、KLK14；第二組KLK9、KLK11、KLK15；第三組KLK10、KLK12；第四組KLK6、KLK13；最后一組KLK8和KLK1、KLK2、KLK3。而這15個基因中迄今為止只有KLKl、KLK2和KLK3具有特異性生物學功能，與疾病的研究較為深刻，其他基因的研究報道極少。

KLK1主要是通過低分子激肽原釋放賴氨酰緩激肽即胰激肽原發揮其生物學功能。然而，KLK1不同的表達形式提示在不同類型細胞中該酶表現不同的專一性。KLK1除發揮其激肽原酶功能外，根據它在垂體和胰腺等組織的存在表明它能對肽類激素和生長素進行加工處理。KLK1能降解胰島素原、LDL、心房尿鈉素前體、凝乳酶原、血管腸肽、前膠元酶、血管緊張素原等。在每一類型細胞中KLK1都可能有單一的或多重的或常見的或獨特的功能。但是，研究表明激肽釋放才是最主要的生理功能，起到擴張毛細血管，改善微循環的作用，產生舒張毛細血管和擴張小動脈等藥理作用。KLK2，KLK3和KLK1的天然底物不同，與KLK1相比，具有非常低的活性，而其他激肽原酶有的與生理過程有關，有的與疾病的病理過程有關，但無一具有特異性基質水解作用。

激肽原酶KLK1臨床用于糖尿病并發癥、高血壓及急性缺血性腦卒中等疾病的治療。較為常見的產品主要有兩類：一類是從豬胰臟提取的激肽原酶(例如常州千紅制藥的“怡開”)，另一類是人尿激肽原酶(例如廣州天普的“尤瑞克林”)，其主要由人尿中提取，上述產品均存在來源有限，生產工藝難以穩定可控，病毒污染風險，從而導致最終產品生產工藝復雜，批次生產一致性較差，成本較高。