[發明專利]一種離體培養提高甜葉菊RA含量的方法

在審

• 申請號: 201611106089.5
• 申請日: 2016-11-28
• 公開（公告）號: CN108112474A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 鄭成淑;唐琪;王珍珍
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種離體培養提高甜葉菊RA含量的方法，包括：將甜葉菊葉片接種到誘導愈傷組織的培養基上，產生愈傷組織后轉入到分化培養基中，幼芽形成后轉入到生根培養基中，長出根系后通過馴化移栽到溫室內進行常規栽培管理。本發明屬于細胞生物學和生物技術領域。本發明得出了快速獲得RA含量高的甜葉菊植株的方法，提高了甜葉菊葉片RA的含量，口感更佳。

技術領域

本發明涉及甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)離體培養提高甜葉菊葉片中RA含量的方法，屬于細胞生物學和生物領域。

背景技術

甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)為菊科甜菊屬多年生草本植物。甜葉菊原產南美巴拉圭地區，其葉片中含有甜菊糖苷(stevioside，ST)，其甜度為蔗糖的200-300倍，是天然的高甜度低能量型甜味物質。經現代科學證明，甜葉菊對高血壓、糖尿病、動脈硬化、冠心病患者有較好的防治效果，喝甜菊茶，能幫助解除精神疲勞，促進新陳代謝，有益于人體健康，是現代安全保健糖料。目前，已有研究表明甜菊糖苷類物質有萊鮑迪苷A(Rebaudioside A，RA)、RB、RC、RD、RE、RF、RM以及甜菊苷(Stevio Glycoside，SS)等多種化合物。甜菊糖苷的化學成分由雙萜苷元(非糖體部分)和糖基(主要是葡萄糖)組成。甜菊糖苷的甜味和苦味是由人體舌頭味覺細胞上的糖受體和苦味受體對甜菊糖苷中的非糖體和葡糖基所識別而感覺到。其中，甜味和苦味主要由非糖體部分和C13、C19位的R1和R2上的糖基數量決定。糖基多的甜菊糖苷RA比其他的甜菊糖苷味道更甜更接近蔗糖的甜度，而苦味較少。因此，培育高RA甜葉菊新品種對于進一步開拓甜菊糖作為甜味劑市場具有重要意義。

通過雜交育種培育高RA含量甜葉菊新品種和通過栽培提高甜葉菊RA含量都是可行的方案。已有研究表明，不同品種甜葉菊葉片RA含量有很大差異，如SR-2基因型甜葉菊ST含量達到12.87％，而RA含量僅為0.02％；而SR-3基因型甜葉菊的RA含量則達到了9.35％，ST含量只有1.23％；SR-3型甜葉菊具有更高的品質，同時SR-3甜葉菊葉片中的UGT76G1基因的表達量也遠遠高于SR-2。說明提高UGT76G 1基因等的表達量可以提高RA含量。也有研究表明，植物調節劑配合氮磷鉀復合肥料(N∶P∶K＝15％∶15％∶20％)施肥，可以增加甜葉菊葉片RA含量11.6％，有機肥與化肥混合施用，可以提高甜葉菊葉片RA含量10％以上。說明通過高RA優良單株之間的雜交，或通過氮磷鉀不同配比施肥的栽培均能不同程度地提高甜葉菊葉片RA含量。但雜交育種方法需要時間較長，而通過施肥提高的RA含量不能在下一代穩定遺傳等，均有一定的局限性。

從甜葉菊生物合成途徑角度分析，甜菊糖是由葉綠體內合成的貝殼杉烯，轉運至內質網膜進而合成為甜菊醇，甜菊醇在液泡中合成為甜菊糖的各組分物質，甜菊醇在各種尿苷二磷酸糖基轉移酶的作用下按步驟分別生成甜菊單糖苷、甜菊雙糖苷、甜菊糖苷及甜菊糖A苷(RA)，最終在液泡中大量積累儲存。

另一方面，我們考慮到甜葉菊從葉片脫分化形成大量愈傷組織的過程中細胞內物質需要重新合成和分配。從上述RA生物合成途徑角度可以推測，RA在細胞中的合成需要很多中間產物作為底物合成的，如果細胞內沒有足夠的RA生物合成前體物，那么外源提供RA也可能為細胞內的RA合成提供物質基礎的。但是通過愈傷組織提高甜葉菊葉片RA含量的研究未見報道。因此，我們嘗試通過組培過程中從開始誘導愈傷組織的培養基中添加外源RA，試圖獲得甜葉菊植株葉片中RA含量較高的株系。

發明內容

本發明的目的在于，快速獲得RA含量高的甜葉菊植株，以解決上述問題。

本發明所解決的問題可以采用以下方案來解決：

一種快速獲得RA含量高的甜葉菊植株方法，其特征在于，包括以下步驟：

采用200mg/g RA添加到外植體為甜葉菊葉片的誘導愈傷組織培養基MS+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA中。