[發明專利]基于顏色判定的環介導等溫擴增(LAMP)技術檢測雪松疫霉根腐病菌

有效

• 申請號: 201611084037.2
• 申請日: 2016-11-30
• 公開（公告）號: CN106636371B
• 公開（公告）日: 2020-06-19
• 發明（設計）人: 紀睿;曾丹丹;廖太林;鄭小波;張正光;周銳;吳軍
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國昆山出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/645
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了一種基于顏色判定的環介導等溫擴增（LAMP）技術檢測雪松疫霉根腐病菌的分子檢測方法及其引物，引物序列分別如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示。本發明的檢測體系在62°C等溫條件下，能快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到雪松疫霉根腐病菌，且不需要復雜儀器，為雪松疫霉根腐病菌的檢測提供了新的技術平臺，能較好滿足對雪松疫霉根腐病菌的現場檢測，適用于出入境植物和植物產品的檢驗檢疫和病害的調查、快速診斷及監測等，對防止雪松疫霉根腐病菌傳入我國具有重要意義，同時，本發明體系的建立也為其他病原菌的檢測提供了技術指導和理論依據。

技術領域

本發明涉及一種檢測雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis Tucker etMibrath)的LAMP引物，以及利用所述引物檢測雪松疫霉根腐病菌的分子檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

雪松疫霉根腐病菌是一用于種重要的毀滅性植物病原菌，可侵染美國扁柏Chamaecyparis lawsoniana(A.Murray bis)Parlatore引起嚴重的根腐病。病害最早于1923年在美國西雅圖、華盛頓附近的觀賞植物上有報道發生，直到1942年，病菌在美國俄勒岡州的威拉梅特谷被發現并命名，病菌造成俄勒岡州西北部和華盛頓西部觀賞植物的嚴重經濟損失，使極具價值的園藝栽培種幾乎全部毀滅，隨后病菌傳入加拿大、法國，對當地觀賞植物及林業貿易造成嚴重影響^[1]。由于該病害為害重、傳播快，而防治根除又極為困難，該病原菌已引起歐盟等許多國家的高度重視，紛紛采取措施嚴防其傳入。近年來，由于國際間苗木及其植物包裝材料的調運日趨頻繁，該病原菌極可能傳入我國，一旦傳入，將對我國農林業、生態環境等造成重大威脅。由于我國未有雪松疫霉根腐病菌發生的報道，國家質檢總局于2007年將該病菌列入新修訂的《進境植物檢疫性有害生物名錄》中。為了防止該病原菌傳入我國，需要對其進行快速、準確地檢測，因此針對雪松疫霉根腐病菌的檢測我們進行了一系列的研究。

雪松疫霉根腐病菌(Phytophthora lateralis TuckerMilbrath)又名側生疫霉，隸屬藻菌界(Chromista)，卵菌門(Oomycota)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉屬(Phytophthora)，是一類重要的植物病原菌，其地理分布和寄主范圍均很廣泛。病菌在V8培養基上生長速度較慢(2mm/d～4mm/d)，菌落平貼至中度的蓬松。最低生長溫度為3℃，最適生長溫度20℃，最高生長溫度26℃。菌絲無隔、分枝多而短，無色，常見的是光滑的，偶爾也有粗糙的，長時間培養后會在培養基上形成一層薄膜。可產生菌絲膨大體，最終形成厚垣孢子，厚垣孢子棕褐色，直徑22μm～77μm，平均40μm，無柄，單個生于孢子梗頂端。病菌孢子囊無乳突，叢生于孢囊梗上，卵圓形、倒卵形、倒梨形，20μm～60μm×12μm～20μm(平均26μm×15μm)，長寬比1.67～5:1，平均1.73:1，游動孢子有側生雙鞭毛，直徑為10μm～12μm。病菌為同宗配合，雄器側生，藏卵器球形、光滑，卵孢子滿器、壁厚約6μm，直徑28μm～46μm，平均40μm^[1]。

傳統病原菌的分類、鑒定主要基于形態學特性、致病性測定等，操作繁瑣，耗時長、靈敏度低、易受人為及環境等諸多因素的干擾^[2]，隨著分子生物學的發展，分子生物學技術已逐步應用到雪松疫霉根腐病菌的研究中。基于普通PCR的方法已經成功用于檢測雪松疫霉根腐病菌^[3,4]，雖然普通PCR法在特異性和靈敏度上有較大的提高，但是檢測時間仍然比較長，大概4～5h，同時普通PCR方法依賴精密的溫度循環裝置，檢測過程復雜，不能滿足快速檢測的需求。