[發明專利]復合酶制劑高效降解黃曲霉毒素B1的制備方法

在審

• 申請號: 201611063531.0
• 申請日: 2017-02-27
• 公開（公告）號: CN106636017A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 王樂;黃巍;殷海成;王金水;胡元森
• 申請（專利權）人: 河南工業大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;A23L5/20
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于酶制劑領域，涉及一種高效降解黃曲霉毒素B1的復合酶制劑的制備方法。

背景技術

黃曲霉毒素是一個典型的真菌次生代謝產物，其具有極強致癌、致畸、致突變性作用。黃曲霉的主要作用器官是肝臟，并能誘發肝細胞癌變，給人類和動物帶來巨大的危害。黃曲霉毒素污染的范圍比較廣泛如花生、玉米、干果、牛奶等日常食物，因其毒性巨大，而越來越受關注。黃曲霉毒素對糧食的污染嚴重影響到各國的進出口貿易，給經濟帶來了巨大的損失。

黃曲霉毒素在結構上是由一個雙呋喃環和一個氧雜萘鄰酮環組成，其結構式中的不飽和內酯環結構以及雙呋喃環是黃曲霉毒素強致癌性的原因。黃曲霉毒素B1是毒性最強的一種，當內酯環結構被破壞時，熒光性會消失，毒性也會隨之減弱，因此將毒素降解的關鍵是將其結構破壞。傳統方法去除黃曲霉毒素主要有物理吸附、臭氧處理、酸堿調控處理、輻射處理，但是傳統物理化學方法處理黃曲霉毒素包含降解效率低，副產物多，操作復雜，成本高昂的缺點，因此迫切需求一種安全高效降解黃曲霉毒素的方法。

生物法降解黃曲霉毒素成為當今的熱點，利用具備降解能力的真菌或者細菌降解黃曲霉毒素。經研究微生物降解黃曲霉毒素主要分為微生物吸附和微生物降解兩種。微生物對黃曲霉毒素的降解主

要是其所產酶起作用效果。研究不同菌體胞外酶按照一定的組分百分比混合制成復合酶制劑高效降解黃曲霉毒素B1的研究甚少。

發明內容

本發明在于提供一種高效降解黃曲霉毒素B1的復合酶制劑的制備方法。

本發明的好食脈胞菌、雷斯青霉來自于實驗室保藏，真菌漆酶源自于試劑公司購買。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種高效降解黃曲霉毒素B1的復合微酶制劑：由好食脈胞菌和雷斯青霉的粗酶制劑與真菌漆酶按照一定的組分百分比混合而成。

進一步在制備復合酶制劑時，由好食脈胞菌和雷斯青霉的粗酶制劑以及真菌漆酶分別以一定的組分百分比混合而成，并確保各自所占組分百分比在區間20%～60%以內，并且兩組分之和為100%。

本發明高效降解黃曲霉毒素B1的復合酶制劑的制備方法包括以下步驟：

（1）發酵培養好食脈胞菌以及雷斯青霉，并將各自培養液置于離心管內離心5500rpm離心10分鐘，將上清液與下層菌體分開，將上清液超濾濃縮10倍，采用50%的飽和硫酸銨沉淀，10000轉離心5分鐘，棄去上清，將沉淀蛋白進行磷酸鹽緩沖液復溶，透析過夜之后進行冷凍干燥，進而將得到蛋白作為好食脈胞菌和雷斯青霉的粗酶制劑。

（2）將上述好食脈胞菌粗酶制劑、雷斯青霉的粗酶制劑和真菌漆酶

混合制成復合酶制劑，其中三者都滿足所占組分百分比在區間20%～60%以內，并且三組分之和為100%。

利用國標法（編號：GB/T 17480-2008）檢測黃曲霉毒素B1的含量。黃曲霉毒素B1降解率利用以下公式計算:降解率=(1-樣品中AFB1峰面積/空白對照中AFB1的峰面積)×100%。

黃曲霉毒素B1的制?。喝》鬯榈挠衩住⒒ㄉ?、小麥于錐形瓶中，加入蒸餾水攪拌均勻，滅菌之后接種黃曲霉菌懸液，置于恒溫培養箱培養一周左右，取被黃曲霉污染的樣品與燒杯中，加入甲醇充分攪拌使黃曲霉素充分溶解，紗布過濾殘渣，向濾液中加入氯仿充分振蕩萃取，取下層氯仿于旋轉蒸發儀蒸干，色譜甲醇溶解，并于0.22微米濾膜過濾，利于HPLC進樣并收集黃曲霉毒素B1出峰區間的流出樣，進而得到純化的黃曲霉毒素B1，檢測其純度可達95%。

本發明在研究復合酶制劑降解黃曲霉毒素B1的過程中，充分考慮到環境因素對其降解效果的影響。經過研究發現，通過控制降解溫度以及降解pH，在相同的溫度以及pH下，復合酶制劑對黃曲霉毒素B1的降解能力相比好食脈胞菌粗酶制劑、雷斯青霉粗酶制劑、真菌漆酶分別單獨降解同等濃度的黃曲霉毒素B1的降解率有顯著的提升。

本發明考慮到將降解黃曲霉毒素B1作用位點存在差異的酶混合，充分發揮不同種類酶在體系中的互補作用以及與酶在降解毒素的過程中相互促進作用。研究環境因素影響對復合酶制劑降解黃曲霉毒素B1效率的過程中，控制降解黃曲霉毒素B1的溫度為33℃～37℃，pH為5～7.5，以及酶液濃度和作用時間等重要條件。復合酶制劑在同等條件下降解黃曲霉毒素B1的效率相比好食脈胞菌粗酶制劑、雷斯青霉粗酶制劑與真菌漆酶分別單獨降解黃曲霉毒素B1的效率提高25%以上。