[發明專利]啟動子文庫及其構建方法

有效

• 申請號: 201611061295.9
• 申請日: 2016-11-24
• 公開（公告）號: CN106754866B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 李霞;李飛飛;李炳志;元英進
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/81;C12Q1/6806;C12Q1/02;C40B50/06;C40B40/06
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種啟動子文庫及其構建方法。本發明以釀酒酵母V號染色體為參考序列，批量設計引物PCR擴增啟動子片段，基于II_S型限制性核酸內切酶及環形聚合酶延伸法進行連接組裝，構建表征載體，轉化釀酒酵母形成基本包含全染色體啟動子的啟動子文庫，培養重組菌株以綠色熒光強度表征啟動子調控狀態。本發明通過聯合多種組裝策略實現重組表征載體的無痕構建，并對染色體尺度上啟動子整體表征，可以快速系統地篩選得到實驗條件下各種不同強度的啟動子，此方法有利于啟動子的研究、挖掘及應用。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種啟動子文庫及其構建方法。

背景技術

啟動子是調控基因表達的重要元件，基因組上多數基因都在轉錄因子、啟動子和RNA聚合酶共同作用下轉錄生成mRNA，tRNA，rRNA或非編碼RNA，發揮生命活動必需的功能。作為重要的遺傳資源，已經有很多的組成型或者誘導型啟動子被表征確認，通過篩選廣泛應用于基因工程上，如大腸桿菌Lac、Trp、Tac和T7啟動子，釀酒酵母TDH3、TEF1和GAL1啟動子，畢赤酵母AOX和GAP啟動子等。基于對生命活動中基因調控理解的需求，代謝工程中途徑構建的需求，和合成生物技術中對各種標準化啟動子元件的需求，更多不同種類的啟動子需要被表征和篩選，從中挖掘具有研究意義和應用潛力的啟動子。對于啟動子常用的表征方法包括基于熒光蛋白報告系統(如GFP、YFP)熒光強度，熒光素酶報告系統熒光強度，β-半乳糖苷酶LacZ酶活，β-葡聚糖苷酶GUS酶活等。

為了滿足對啟動子不同強度、不同功能多樣性的需求，啟動子文庫應運而生，顧名思義就是很多不同啟動子的集合。構建一個人工啟動子文庫方法主要有非保守序列隨機化、易錯PCR、雜合啟動子工程、理性設計轉錄因子結合位點等，這些人工啟動子的設計不同程度上來源于對天然啟動子的研究和分析，因此對于天然啟動子表征篩選挖掘是強度功能多樣化啟動子文庫構建的基礎。

新型的啟動子也最可能從對天然啟動子的研究中發現，而傳統上，對于天然啟動子的表征規模數量上常局限于單個或幾個啟動子，沒有一套在基因組尺度或染色體尺度進行系統表征的方法。當前，基因組學的發展已為我們提供了海量的基因組信息，作為模式生物釀酒酵母的全基因組序列也早于1996年即公布，隨后長期以來對于基因功能注釋的不斷完善，都為啟動子的批量系統表征和挖掘提供了重要參考。

發明內容

有鑒于此，本發明針對天然啟動子多樣化的需求，及個別啟動子鑒定表征的不足，首次提供了一種系統構建天然啟動子文庫并對其表征的方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種啟動子文庫的構建方法，包括如下步驟：

截取啟動子區域；

分析酶切位點，設計引物；

擴增獲得啟動子片段；

取所述啟動子片段與表達載體構建重組載體；

取所述重組載體轉化宿主并篩選；

獲得目標啟動子。

在本發明的一些具體實施方案中，所述截取啟動子區域具體為：

對于同向相鄰兩蛋白編碼基因間隔區小于800bp～1200bp的DNA序列，取其間隔序列作為啟動子區；

對于間隔區長度不小于1200bp的，取5’上游1200bp作為啟動子區。

在本發明的一些具體實施方案中，所述分析酶切位點為分析是否含有IIs型限制性核酸內切酶位點。

在本發明的一些具體實施方案中，所述IIs型限制性核酸內切酶為BsaI或BsmBI。

在本發明的一些具體實施方案中，所述設計引物具體為：