[發明專利]一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體

有效

• 申請號: 201611057003.4
• 申請日: 2016-11-26
• 公開（公告）號: CN108118043B
• 公開（公告）日: 2020-05-19
• 發明（設計）人: 閆云君;李冠霖;蘇楓;陳苑;方興容;徐莉
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: C12N9/20
• 分類號: C12N9/20;C12N15/55;C12N15/11
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒

本發明提供了一種褶皺假絲酵母脂肪酶突變體，采用定點突變技術對褶皺假絲酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(CRL1)進行熱穩定性改造以優化其在工業高溫環境下的實用性。本發明以CRL1基因為模板，利用蛋白質理性設計技術，通過將CRL1脂肪酶基因序列編碼氨基酸第457位的氨基酸由Asp替換成Phe，而獲得熱穩定性提高的脂肪酶突變體，提高了該酶的應用范圍與催化效率。運用分子生物學方法對CRL1進行定點突變，獲得脂肪酶突變體，脂肪酶突變體的Tm值提高9.4℃，最適溫度提高10℃，T_1/2(50℃)是親本脂肪酶的6.5倍。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地，涉及一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體以及脂肪酶基因。

背景技術

酶作為一種天然的生物催化劑，具有反應條件溫和、催化效率高、底物選擇特異性高等傳統催化方法所不可比擬的優點，在工業生產中具有巨大的應用潛力和良好的發展前景，但工業生產中常常需要較高的反應溫度，一方面，高溫條件下進行反應能夠顯著地降低反應物被微生物污染的概率，同時還可以增加底物的溶解性，使底物與酶更易接觸；另一方面，一般而言，反應溫度每增加10℃，反應速率就會提高兩倍。因此，如果酶在高溫下能夠保持穩定的催化活力，就能隨著反應速率的增加，縮短相應的轉化時間，繼而減少在反應過程中的需酶量，從而降低生產成本。大多數的酶蛋白分離于常溫菌，這些酶蛋白經過長期的自然選擇，已充分適應了生物體的催化要求，通常只能在較為溫和的環境下發揮作用，這使得酶在其熱穩定性上具有一定的局限性，過高的溫度會影響蛋白質的穩定性，甚至導致其完全變性而喪失活力，使酶不能在工業條件下最大程度的發揮其作用，這嚴重制約了它們在工業生產中的應用。因此，建立一套高效的改良方法來提高酶的熱穩定性是一件刻不容緩的事情。

褶皺假絲酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1，CRL1)與其他七種同工酶相比有著更高的表達量和水解、轉酯、酯化活力，同時，由于其獨特的催化性質(如立體選擇性等)現已被廣泛地應用于生物醫藥(手性拆分)、食品、生物柴油等多個領域中。但CRL1作為一種常溫酶，具有較差的熱穩定性，這一不足嚴重制約了其工業化應用。

發明內容

針對現有技術的以上缺陷或改進需求，本發明提供了一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體，由親本褶皺假絲酵母(ATCC NO:14830)脂肪酶LIP1(Candida Rugosa Lipase 1,CRL1)進行定點突變，獲得熱穩定性提高的脂肪酶突變體，親本CRL1氨基酸序列在氨基酸取代位置發生突變，采用“原始氨基酸/位置/替換氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸，所述脂肪酶突變體為Asp457Phe，以解決現有技術的褶皺假絲酵母脂肪酶LIP1(CRL1)熱穩定性差的技術問題。

為實現上述目的，按照本發明的一個方面，提供了一種熱穩定性提高的脂肪酶突變體，所述脂肪酶突變體為親本褶皺假絲酵母脂肪酶LIP1的氨基酸序列在氨基酸取代位置發生突變的突變體，采用“原始氨基酸/位置/替換氨基酸”來表示脂肪酶突變體中突變的氨基酸，所述脂肪酶突變體為Asp457Phe。

優選地，所述脂肪酶突變體的序列為：

(1)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或

(2)與序列SEQ ID No.1限定的氨基酸序列同源性在80％至100％編碼相同功能蛋白質的氨基酸序列；或

(3)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經增加、缺失或替換一個或多個氨基酸具有同等活性的由(1)衍生的蛋白。

優選地，用于表達所述脂肪酶突變體的表達載體為pPIC9K，pPIC3.5K，pPICZα或pPICZ。

優選地，用于所述表達載體轉化的微生物宿主細胞為畢赤酵母。