[發(fā)明專利]免提取直接擴(kuò)增的人PAH基因SNP分型快速試紙條檢測方法及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611053788.8
• 申請(qǐng)日: 2016-11-25
• 公開（公告）號(hào): CN108118081B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉梟男;崔亞麗;張學(xué);張朝;朱娟莉;惠文利;劉克武
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 金磁（蘇州）納米科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6804
• 分類號(hào): C12Q1/6804
• 代理公司: 常州佰業(yè)騰飛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32231
• 代理人: 黃杭飛

本發(fā)明公開一種免提取直接擴(kuò)增人PAH基因7個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)(R111X、IVS4?1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P)的快速試紙條檢測方法及試劑盒。該方法包括以下幾個(gè)步驟：采集的樣本直接添加處理液制備成樣本液；基于AS?PCR的方法，對(duì)SNP等位基因位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增；利用擴(kuò)增片段標(biāo)記的地高辛和納米金磁微粒表面的地高辛單抗相互作用，結(jié)合側(cè)向流層析技術(shù)，實(shí)現(xiàn)基因的快速分型。本發(fā)明所提供的檢測方法，不經(jīng)過DNA的分離提取過程，同時(shí)以表面修飾的金磁微粒作為雜交載體，省去核酸純化和產(chǎn)物處理環(huán)節(jié)而導(dǎo)致的高成本、費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的問題的同時(shí)，取得了高靈敏度和準(zhǔn)確性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于SNP檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種免提取直接擴(kuò)增的人PAH基因SNP分型快速試紙條檢測方法。

背景技術(shù)

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種常見的氨基酸代謝異常疾病，由苯丙氨酸代謝途徑中的苯丙氨酸羥化酶基因(PAH)缺陷，導(dǎo)致苯丙氨酸轉(zhuǎn)化成酪氨酸的途徑受阻，從而造成苯丙氨酸和苯丙酮酸的積累，并影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的合成。PKU為常染色體隱形遺傳，主要引起新生兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，主要臨床特征為智力低下、精神神經(jīng)癥狀、腦電圖異常、濕疹、皮膚抓痕征及色素脫失和鼠氣味等。苯丙氨酸在各國的發(fā)病率不同，平均約為1/15000人，而在我國的發(fā)病率為1/11144人，高于世界平均水平。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了PAH基因的560多種突變，涉及到PAH基因的13個(gè)外顯子；在中國人群中發(fā)現(xiàn)的PAH致病突變也超過100種。針對(duì)PKU的13個(gè)外顯子進(jìn)行測序，可以尋找到95％的遺傳病因，仍有5％的遺傳病因尚不清楚。

PKU患兒出生時(shí)大多表現(xiàn)正常，新生兒期多無明顯臨床癥狀，或出現(xiàn)濕疹、吐奶等非特異性癥狀。若不及時(shí)治療，會(huì)逐漸出現(xiàn)典型癥狀：毛發(fā)顏色由黑變黃，皮膚白，頑固的濕疹，汗液和尿液有特殊的鼠尿味，并伴有智力、運(yùn)動(dòng)能力發(fā)育落后。隨著年齡增長，PKU患兒智力低下會(huì)越來越明顯，呈現(xiàn)中到重度的智力殘疾，說話、走路均較同齡兒童晚，年長兒出現(xiàn)學(xué)習(xí)困難，嚴(yán)重者甚至生活不能自理，終生需要他人護(hù)理。除智力障礙外，還會(huì)出現(xiàn)一些精神行為方面的異常，如：煩躁易怒、攻擊行為等。部分患兒合并癲癇，常在18個(gè)月以前出現(xiàn)，可表現(xiàn)為嬰兒痙攣性發(fā)作，點(diǎn)頭樣發(fā)作或其他形式，常規(guī)的抗癲癇治療難以控制。PKU患兒通過早期診斷并采用飲食控制或藥物治療方法可有效阻斷病程發(fā)展，有希望像正常孩子一樣成長，因此對(duì)于PKU患兒的早期檢出和治療是非常必要的。

SNP分型檢測技術(shù)是一種重要的基因檢測技術(shù)，已有技術(shù)包括熒光定量PCR法、基因芯片雜交法、PCR結(jié)合凝膠電泳法、PCR結(jié)合毛細(xì)管電泳法、PCR結(jié)合酶切方法、DNA直接測序法等。這些方法普遍存在操作復(fù)雜、檢測時(shí)間長，或需要價(jià)格昂貴的大型儀器設(shè)備等方面的限制，且這些方法都需要從樣本中純化得到DNA，復(fù)雜繁瑣的純化步驟不但損耗大量時(shí)間，而且增加了造成樣本間交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，因此并不適合于大多數(shù)臨床醫(yī)院在常規(guī)的臨床檢驗(yàn)中推廣使用。所以，研究并開發(fā)免提取直接擴(kuò)增且簡便省時(shí)，無需大型儀器設(shè)備的SNP分型檢測方法無論是對(duì)于PKU患兒還是對(duì)于該疾病機(jī)理的實(shí)驗(yàn)室研究，都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種免提取直接擴(kuò)增的人PAH基因SNP分型快速試紙條檢測方法，包括以下步驟：

(1)樣本處理：取少量樣本，加入樣本處理液10μL，靜置5分鐘后直接作為模板進(jìn)行下一步反應(yīng)；

(2)針對(duì)待檢測PAH基因R111X、IVS4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七個(gè)位點(diǎn)，每一個(gè)位點(diǎn)分別設(shè)計(jì)一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進(jìn)行識(shí)別與擴(kuò)增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的5′端均標(biāo)記地高辛，共用引物的5′端標(biāo)記生物素；

(3)針對(duì)每一個(gè)樣本的每一個(gè)位點(diǎn)，平行做兩管PCR反應(yīng)，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件相同并同時(shí)置于PCR儀中反應(yīng)，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；