[發明專利]免提取直接擴增的人PAH基因SNP分型快速試紙條檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201611053788.8
• 申請日: 2016-11-25
• 公開（公告）號: CN108118081B
• 公開（公告）日: 2021-07-06
• 發明（設計）人: 劉梟男;崔亞麗;張學;張朝;朱娟莉;惠文利;劉克武
• 申請（專利權）人: 金磁（蘇州）納米科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6804
• 分類號: C12Q1/6804
• 代理公司: 常州佰業騰飛專利代理事務所(普通合伙) 32231
• 代理人: 黃杭飛

1.一種非診斷目的的免提取直接擴增的人PAH基因SNP分型快速試紙條檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)樣本處理：取少量樣本，加入樣本處理液10μL，靜置5分鐘后直接作為模板進行下一步反應；

(2)針對待檢測PAH基因R111X、IVS4-1、Y204C、R243Q、W326X、Y356X和R413P七個位點，每一個位點分別設計一條野生型特異性引物、一條突變型特異性引物和一條共用引物進行識別與擴增；在野生型特異性引物和突變型特異性引物的5′端均標記地高辛，共用引物的5′端標記生物素；

(3)針對每一個樣本的每一個位點，平行做兩管PCR反應，其中一管加入共用引物與等量的突變型特異性引物，另一管中加入共用引物與等量的野生型特異性引物，兩管的PCR反應體系和反應條件相同并同時置于PCR儀中反應，獲得擴增產物；

(4)利用地高辛單抗修飾的金磁微粒特有的可目視化特性，采用層析技術并以地高辛和地高辛單抗作用、生物素和鏈親和素作用，對步驟(3)得到的擴增產物進行試紙條分型檢測，判讀基因型，滴加含有野生型特異性引物的擴增產物在試紙條的檢測線上顯色，而含有突變型特異性引物的PCR產物在試紙條的檢測線上不顯色，則表明基因型為野生型；反之基因型為突變型；若兩支試紙條的檢測線均顯色，則表明基因型為雜合型；

步驟(1)中所述樣本處理液為50mM-150mM的無機堿性溶液；

步驟(2)中所述R111X位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-TACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTAG-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-TACCTGTGTCTTTCTTCTTATCTAA-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-TCTTTGGCCTGCGTTAGTTC-3'；步驟(2)中所述IVS4-1位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-AAATCAGGTGTCTCTTTTCTCCTTG-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-AAATCAGGTGTCTCTTTTCTCCTTA-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-CTGGTATTTTCCATCCTCAACTG-3'；：步驟(2)中所述Y204C位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-TGTATAAAACCCATGCTTGCGA-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-TGTATAAAACCCATGCTTGCGG-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-TCAATCCTCCCCCAACTTTC-3'；步驟(2)中所述R243Q位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-CACTGGTTTCCGCCTCAG-3'；突變型特異性引物核苷酸序列 為：5'-digoxin-CACTGGTTTCCGCCTCAA-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-AGCCAGCAATGAACCCAAAC-3'；步驟(2)中所述W326X位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-AGCCCAAACTCCACAGTAAATC-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-AGCCCAAACTCCACAGTAAAAT-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-CACTGACTCACATGCCAATCC-3'；步驟(2)中所述Y356X位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-GCTTTGGCTTCTCTGATAAGCTG-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-GCTTTGGCTTCTCTGATAAGCTT-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-TTTCTCCCTTGGCTGTAGGTTTT-3'；步驟(2)中所述R413P位點野生型特異性引物的核苷酸序列為：5'-digoxin-TTGGGTGTATGGGTCGTAAC-3'；突變型特異性引物核苷酸序列為：5'-digoxin-TTGGGTGTATGGGTCGTAAG-3'；共用引物核苷酸序列為：5'-Biotin-TAGGGAGGTGTCCGTGTTC-3'。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于：步驟(1)中所述樣本類型是DNA樣本、全血樣本或口腔拭子樣本。