[發明專利]一種?？谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒

有效

• 申請號: 201611052512.8
• 申請日: 2016-11-25
• 公開（公告）號: CN106596966B
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發明（設計）人: 常惠蕓;劉澤眾;邵軍軍;趙付榮;李秀梅;張永光
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/569;G01N33/531;G01N21/76;C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12N15/66
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙) 41120
• 代理人: 程茗

1.一種?？谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包含96孔化學發光免疫分析板、酶標抗體、血清稀釋液、化學發光底物、化學發光增強劑和PBST洗滌液，其特征在于：所述96孔化學發光免疫分析板包被3ABC融合蛋白，所述3ABC融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述酶標抗體為辣根過氧化物酶標記的兔抗牛lgG抗體；所述血清稀釋液為pH=7.2~7.4且摩爾濃度為10mmol/L的磷酸鹽緩沖液，其中包含體積分數為 0.01% 的Tween-20、質量體積百分數為1%的酪蛋白、體積分數為10%的馬血清和體積分數為1%的大腸桿菌裂解液；所述化學發光底物為0.1mmol/L 的魯米諾溶液；所述化學發光增強劑包含0.07 mmol/L的IPP、3mmol/L的H₂O₂和體積分數為0.002%的Tween-20；

所述3ABC融合蛋白的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、利用基因定點突變技術，獲取突變后的3ABC基因，使其編碼的3ABC蛋白中3C蛋白上的第46位組氨酸突變成酪氨酸和第163位半胱氨酸突變成甘氨酸；所述3ABC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

步驟二、將步驟一獲取的3ABC基因和載體 PproExHtB 均用限制性內切酶 BamHI與XhoI雙酶切后進行連接，將突變后的全長3ABC基因插入線性化的重組表達質粒構建重組表達質粒PproExhTB-mu3ABC，鑒定陽性后保存備用；

步驟三、將步驟二所得陽性重組表達質粒PproExhTB-mu3ABC轉化大腸桿菌Rosetta（DE3），獲取重組大腸桿菌，將重組大腸桿菌接種到培養基上，待OD₆₀₀=0.4-0.6時，向培養基中加入IPTG，在16℃、220rpm條件下處理20h進行誘導表達，經離心、裂解，溶解包涵體，純化蛋白，得3ABC融合蛋白。

2.如權利要求1所述的一種牛口蹄疫3ABC抗體化學發光檢測試劑盒，其特征在于：所述3ABC融合蛋白的包被濃度為250ng/mL。

3.如權利要求1所述的一種牛口蹄疫3ABC抗體化學發光檢測試劑盒，其特征在于：所述大腸桿菌裂解液是將未經轉化的大腸桿菌Rosetta（DE3）培養至對數期，離心，得菌體沉淀；加入與菌體沉淀等體積的裂解緩沖液，混勻，得混合物；向混合物中加入其1/3體積的直徑為0.22μm的玻璃珠，震蕩，離心，取上清，得大腸桿菌裂解液。

4.如權利要求3所述的一種?？谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒，其特征在于：所述裂解緩沖液由以下成分組成：體積分數為2% 的Triton X-100；體積分數為1%的SDS；100mmol/L的NaCl；10mmol/L，pH=8.0的Tris-HCl；1 mmol/L，pH=8.0的 EDTA；余量為水。

5.如權利要求1所述的一種?？谔阋?ABC抗體化學發光檢測試劑盒，其特征在于：所述3ABC基因的獲取過程為：從感染口蹄疫病毒的牛的水皰液中提取總RNA，逆轉錄合成cDNA；設計六組引物，以合成的cDNA為模板，首先利用引物3ABC-F 和3C-46-R 擴增第一段基因；然后利用3C-46-F和3C-163-R擴增第二段基因；再用3C-163-F與3ABC-R擴增第三段基因；最后通過融合PCR將擴增的三段基因融合成突變后的3ABC基因；

所述引物序列如下：

3ABC-F：5'-CGGGATCC ATCTCAATTCCTTCCCAAAAGTCC-3'

3ABC-R：5'-CCGCTCGAGT CTCATGGTGTGGTTCGGGGT-3'

3C-46-F：5'-CGTACCTCGTTACCTTTTCGC-3’

3C-46-R：5'-GCGAAAAGGTAACGAGGTACG-3’

3C-163-F：5'-AGGCTACGGTGGGGGAGC-3'

3C-163-R：5'-GCTCCCCCACCGTAGCCT-3'。