[發明專利]一種血漿或血清游離DNA和RNA的硅膠吸附柱提取試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201611030469.5
• 申請日: 2016-11-16
• 公開（公告）號: CN108070584A
• 公開（公告）日: 2018-05-25
• 發明（設計）人: 黃鈞昱
• 申請（專利權）人: 江蘇然科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 秦力軍

本發明公開一種血漿或血清游離DNA和RNA的硅膠吸附柱提取試劑盒及提取方法，涉及分子生物領域，試劑盒包括蛋白酶K、異丙醇、無水乙醇、三蒸水，還包括：含有核酸分離促進劑的裂解液；含有核酸吸附促進劑的吸附液，以及洗滌液；其方法主要利用的試劑盒進行。利用本發明提供的試劑盒可以迅速徹底地釋放出血漿或血清中的游離DNA和RNA，并且使變性蛋白質保持溶解狀態，在吸附液的作用下游離DNA和RNA高效地吸附在硅膠吸附柱的上，經洗滌液洗滌后，得到較高純度和濃度的游離DNA和RNA。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種血漿或血清游離DNA和RNA的硅膠吸附柱提取試劑盒及方法。

技術背景

游離DNA簡稱cf DNA(Free circulating/Cell-free DNA)最早被發現于1948年，是一種無細胞狀態的、片段化的胞外DNA，主要存在于血液、滑膜液和腦脊液等體液中。目前游離DNA在無創產前檢測和腫瘤的液態活檢方面的應用是臨床上兩個火熱的領域。除了此之外，游離DNA在器官移植、中風、自身免疫病和心肌梗死等疾病上的應用價值也日益清晰。

游離RNA(cell-freeRNA，cfRNA)是存在于細胞外的轉錄產物，包括mRNA和microRNA。MicroRNA在人的多種體液(血漿、血清、胸腹水、尿液，羊水和唾液等)中被發現，被廣泛研究并成為疾病無創性診斷和研究的新分子標志物，為腫瘤、血液病和心血管疾病的研究開辟了新領域。

隨著血漿(或血清)游離DNA和RNA在臨床上的應用越來越廣泛，血漿(血清)游離DNA和RNA提取也顯得越來越重要。游離DNA和RNA在正常人的血液中含量甚微，能否獲得高質量的游離DNA或RNA是進行分子生物學研究的第一步，也是關鍵的一步，直接影響實驗成敗。

成功的血漿(或血清)游離DNA或RNA提取需要四個重要的步驟：核酸與結合蛋白的分離，核酸的吸附，核酸酶的滅活以及污染物的去除。理想的抽提方法可以獲取高質量的游離核酸，同時沒有蛋白、糖、脂和其它核酸的污染。

目前市場上多采用酚-氯仿法、硅膠磁珠吸附法(磁珠法)和硅膠膜吸附柱法(柱式法)提取血漿(或血清)游離DNA或RNA。酚-氯仿游離DNA或RNA抽提方法操作繁瑣，使用的有機溶劑對人體傷害大，提取效率低，重復性差，不適合血漿(或血清)微量DNA或RNA的提取。硅膠磁珠吸附法和硅膠膜吸附柱法是目前提取游離DNA或RNA主要的兩種方法，這兩種方法在提取游離DNA或RNA方面各有千秋。磁珠法對血漿(或血清)游離小片段DNA或RNA的提取效率高，相對丟失率少，重復性好，單位面積磁珠的吸附量大，尤其適合于自動化。但磁珠法提取的游離DNA或RNA僅適合于少量低濃度的游離核酸提取，因為磁珠法的血漿(或血清)濃縮倍數十分有限。硅膠膜吸附柱法雖然對小片段DNA提取效率低于磁珠法，但是其簡便快速，提取的游離DNA或RNA純度高，重復性好，并且能有效的去除各種PCR抑制物，尤其適合血漿(或血清)用量大的高濃度的游離DNA或RNA提取。如果要獲得大量高濃度的游離DNA或RNA，硅膠膜吸附柱法是目前唯一的選擇。目前硅膠膜吸附柱法最主要的產品為Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit，由于其在游離DNA或RNA提取領域具有非常大的壟斷性，因此價格十分昂貴。

為了有效提高硅膠膜吸附柱法對小片段DNA的提取效率，同時打破國外的壟斷，本發明人積極加以研究創新，以期成功研發一種高效的硅膠吸附柱法血漿(或血清)游離DNA和RNA提取方法，使其更具市場推廣價值。

發明內容

為了有效提高硅膠膜吸附柱法對小片段DNA的提取效率，同時打破國外的壟斷，發明人進行了大量實驗，針對可能的影響因素對提取方法不斷進行完善和優化，由此完成了本發明。

為實現本發明的目的，本發明一方面提供一種游離DNA和RNA的硅膠吸附柱提取試劑盒，包括：

具有核酸分離促進劑的裂解液；