[發(fā)明專利]一種腎陽虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及確定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611015606.8
• 申請(qǐng)日: 2016-11-18
• 公開（公告）號(hào): CN106645746B
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇友新;鄭乃熙;鄭良樸;詹正烜;賴興泉;黃露露;朱亞菊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N27/447;G01N27/62
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊;陳彩芳

本發(fā)明提供一種腎陽虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及確定方法；具體包括樣品松質(zhì)骨總蛋白的提取、蛋白濃度的測(cè)定、雙向凝膠電泳分析、凝膠蛋白點(diǎn)的檢測(cè)與差異蛋白點(diǎn)顯示分析、差異蛋白的MALDI?TOF?MS質(zhì)譜分析以及蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫檢索及鑒定、確定差異蛋白、通過Western?Blot、RT?PCR對(duì)部分差異蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定并與血清中的差異蛋白ELISA檢測(cè)結(jié)果互相驗(yàn)證，表達(dá)趨勢(shì)一致且在正常值范圍之外的差異蛋白可以用作腎陽虛證動(dòng)物模型鑒定的生物標(biāo)志物。本發(fā)明有助于為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中腎陽虛證型提供鑒別指標(biāo)，為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)腎陽虛生物標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域，具體涉及一種腎陽虛證動(dòng)物模型生物標(biāo)志物的篩選及確定方法。

背景技術(shù)

“證”是中醫(yī)學(xué)理論體系的核心，中醫(yī)臨床首重辨證論治，但辨證很大程度上受醫(yī)家自身（如對(duì)中醫(yī)藥知識(shí)的理解、臨床經(jīng)驗(yàn)等）及患者主觀因素的影響，難以客觀化和定量化，造成辨證結(jié)果不統(tǒng)一，影響治法的確立、選方用藥及臨床療效的評(píng)價(jià)，阻礙中醫(yī)學(xué)的研究及發(fā)展。中醫(yī)基礎(chǔ)研究中采用動(dòng)物模型可以模擬疾病的真實(shí)過程，與“證”的生理和病理狀態(tài)相似，因此借助腎陽虛證動(dòng)物模型是研究腎虛證實(shí)質(zhì)的必由之路。

本實(shí)驗(yàn)采用氫化可的松肌肉注射所模擬出的腎陽虛證模型大鼠的癥狀、體征和血清cAMP、cGMP含量檢測(cè)及cAMP/cGMP比值結(jié)果符合目前常用的腎陽虛證模型的鑒定要求，表明本研究的腎陽虛模型制作是成功的，但以上評(píng)價(jià)方法以主觀評(píng)價(jià)為主，評(píng)價(jià)指標(biāo)缺乏特異性、客觀性，研究結(jié)果能否科學(xué)闡明中醫(yī)“證”的實(shí)質(zhì)以及所復(fù)制的動(dòng)物證候模型是否具有代表性，同樣涉及辨證的客觀化和定量化的問題。因此尋找具有一定特異性的客觀指標(biāo)來判別鑒定腎陽虛模型是否成功，是進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。

基于中醫(yī)“腎主骨”的理論，骨組織作為“腎”功能的外在表現(xiàn)部位之一，其內(nèi)在生物學(xué)特征的變化與“腎”的功能狀態(tài)必然存在著密切聯(lián)系。蛋白質(zhì)是體現(xiàn)組織細(xì)胞功能與執(zhí)行生命活動(dòng)最直接的活性物質(zhì)，骨組織的結(jié)構(gòu)與功能狀態(tài)最終體現(xiàn)于其內(nèi)在功能蛋白質(zhì)組和基因組的表達(dá)狀態(tài)。隨著對(duì)疾病中醫(yī)“證”與蛋白質(zhì)組相關(guān)研究的深入，目前已經(jīng)認(rèn)識(shí)到：中醫(yī)“證”的表現(xiàn)實(shí)質(zhì)是疾病個(gè)體特定的功能蛋白質(zhì)組及其基因組的表達(dá)水平；疾病不同中醫(yī)證型之間區(qū)別的實(shí)質(zhì)是功能蛋白質(zhì)組及其基因組表達(dá)水平的差異。因此，通過對(duì)骨組織差異蛋白質(zhì)組表達(dá)水平的檢測(cè)，有望從骨組織功能蛋白質(zhì)組層面上進(jìn)一步揭示中醫(yī)腎陽虛證候的實(shí)質(zhì)。

基于以上理論基礎(chǔ)與研究背景，本研究借助于蛋白質(zhì)組學(xué)研究思路和技術(shù)上的優(yōu)勢(shì)，以大鼠的骨組織（松質(zhì)骨）為研究對(duì)象，分別展示它們?cè)谀I陽虛與正常狀態(tài)下松質(zhì)骨的蛋白質(zhì)組圖譜，比較它們之間存在的差異表達(dá)蛋白質(zhì)，從松質(zhì)骨功能蛋白質(zhì)組層面深入探討中醫(yī)腎陽虛證的實(shí)質(zhì)，進(jìn)一步深化對(duì)中醫(yī)“腎”與骨內(nèi)在關(guān)聯(lián)的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能在腎陽虛證發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，可能是腎陽虛證診斷的潛在生物標(biāo)志物。由于生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)是冗長而又繁雜的過程，需借助多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，從多層面多角度反復(fù)鑒定、驗(yàn)證及確認(rèn)。故對(duì)于初步篩選的差異蛋白，我們需要從蛋白水平、基因水平進(jìn)一步對(duì)靶定蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，以規(guī)避單一實(shí)驗(yàn)方法的局限，保證前期蛋白質(zhì)組學(xué)檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如何選取感興趣的候選蛋白，對(duì)其進(jìn)一步研究，探討其與腎陽虛證的密切聯(lián)系，并同時(shí)證明本生物標(biāo)志物篩選方法的可行性是本研究的重點(diǎn)。

當(dāng)今科技正步入云媒體、大數(shù)據(jù)的時(shí)代，各種信息蜂擁而至，經(jīng)云計(jì)算、大數(shù)據(jù)挖掘，一些功能強(qiáng)大、內(nèi)容豐富、更新頻繁的在線蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫(PPI Database)應(yīng)運(yùn)而生，已成為研究預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)功能重要手段之一。本部分研究利用免費(fèi)在線PPI Database–String10對(duì)前期所鑒定出已知蛋白進(jìn)行系統(tǒng)綜合分析，篩選候選蛋白作進(jìn)一步研究。該數(shù)據(jù)庫覆蓋面廣、整合度高、更新頻率快，并能對(duì)蛋白質(zhì)之間直接和間接相互作用的關(guān)系能做出一定的預(yù)測(cè)，從而可初步在生物信息學(xué)層面對(duì)所鑒定的差異蛋白在疾病中的作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，為對(duì)后續(xù)的驗(yàn)證性研究提供思路。借助于String數(shù)據(jù)庫檢索提供的生物學(xué)信息提示，同時(shí)我們查閱相關(guān)文獻(xiàn)結(jié)合前期研究結(jié)果，我們推測(cè)腎陽虛證癥狀和體征的改變可能與某幾個(gè)關(guān)鍵差異蛋白所在蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控密切相關(guān)。因此我們挑選了Ⅰ型膠原α-1鏈和GDP解離抑制因子1作為驗(yàn)證對(duì)象。