[發(fā)明專利]共轉FPS和DBR2基因提高青蒿素含量的方法及制備的青蒿

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611012726.2
• 申請日: 2016-11-17
• 公開（公告）號: CN106755060B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發(fā)明（設計）人: 唐克軒;石璞;付雪晴;沈乾;江偉民;馬亞男;郝小龍;孫小芬
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

本發(fā)明公開了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，將法尼基焦磷酸合酶FPS基因和青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶DBR2基因共轉化青蒿。通過高效液相色譜?蒸發(fā)光散射檢測器測定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉基因青蒿植株。本發(fā)明獲得的轉基因青蒿中青蒿素的含量顯著提高，最高達到非轉化對照植株的3.36倍。

技術領域

本發(fā)明涉及基因工程技術領域，特別是一種采用兩個關鍵酶基因FPS和DBR2共轉化的青蒿及其制備方法，該青蒿具有提高的青蒿素含量。

背景技術

青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。其地上部分所提取的含有過氧橋的倍半萜內酯化合物——青蒿素，是目前應用最廣泛，療效最好的抗瘧疾藥物，特別是對腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾更加有效。目前，青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)是世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法。但其青蒿素在植物青蒿中的含量很低，尚無法完全滿足全球的市場需求。青蒿具有分泌型腺毛(glandular trichomes)和非分泌型腺毛(non-glandular trichomes)。在青蒿葉片的近軸面和遠軸面、莖稈、花上都大量存在分泌型腺毛，這里是大量次生代謝物的合成和累積場所，青蒿素也被認為合成和儲存于此處。

目前，青蒿素的主要來源是從植物青蒿中提取獲得，作為青蒿中重要的一種植物次生代謝產物，其在青蒿中的含量非常低，大約為青蒿葉片干重的0.1％-1％，且青蒿素含量與青蒿品種、季節(jié)、生長環(huán)境、生長時期等密切相關。極低的生物含量與極大的市場需求，導致青蒿素價格居高不下。

雖然目前通過合成生物學化學半合成青蒿素獲得較大突破，將青蒿素生物合成途徑中的多步關鍵酶基因導入酵母基因組，成功在酵母中獲得高產量的青蒿酸，青蒿酸再在體外經過化學方法合成獲得青蒿素，該方法在實驗室階段獲得成功，但是通過酵母發(fā)酵半合成前期設備成本較大，維護較難，且產量有限，不能完全滿足市場需求。因此通過雜交育種，分子育種，基因工程育種等生物技術手段提高植物青蒿中青蒿素含量的方法仍然具有很大的競爭力和應用價值。

因此，本領域的技術人員致力于開發(fā)一種基因工程方法，打破青蒿素生物合成限速瓶頸，從而獲得青蒿素高產的青蒿植株，為規(guī)模化生產青蒿素提供一條新途徑。

發(fā)明內容

有鑒于現(xiàn)有技術的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種提高青蒿中青蒿素含量的方法及青蒿植株。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一方面提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，在一個具體實施方式中，該方法將法尼基焦磷酸合酶FPS基因和青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶DBR2基因共轉化青蒿。

進一步地，F(xiàn)PS基因的序列如SEQ ID No.1所示，DBR2基因的序列如SEQ ID No.2所示。

進一步地，該方法包括步驟：

1)采用基因克隆方法獲得FPS基因和DBR2基因；

2)將所述FPS基因和DBR2基因連接于表達調控序列，形成含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達載體；

3)將所述含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達載體轉化根癌農桿菌，獲得用于轉化青蒿的含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達載體的根癌農桿菌菌株；

4)將含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達載體的根癌農桿菌菌株轉化青蒿，獲得轉基因青蒿植株。

進一步地，步驟2)中，含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達載體的構建包括如下步驟：分別將FPS基因和DBR2基因連接到中間載體上，經過雙酶切后將FPS基因和DBR2基因分別連入表達載體上，獲得CaMV 35S-FPS-nos和CaMV 35S-DBR2-nos表達盒；通過無縫克隆技術將CaMV 35S-FPS-nos和CaMV 35S-DBR2-nos表達盒連入另一表達載體中，獲得所述植物雙元表達載體。