[發(fā)明專利]共轉(zhuǎn)FPS和DBR2基因提高青蒿素含量的方法及制備的青蒿

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611012726.2
• 申請(qǐng)日: 2016-11-17
• 公開（公告）號(hào): CN106755060B
• 公開（公告）日: 2020-05-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐克軒;石璞;付雪晴;沈乾;江偉民;馬亞男;郝小龍;孫小芬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00;A01H6/14
• 代理公司: 上海旭誠知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，將法尼基焦磷酸合酶FPS基因和青蒿醛Δ11(13)雙鍵還原酶DBR2基因共轉(zhuǎn)化青蒿，包括步驟：

1)采用基因克隆方法獲得FPS基因和DBR2基因；

2)將所述FPS基因和DBR2基因連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體，所述植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建包括如下步驟：分別將FPS基因和DBR2基因連接到中間載體上，經(jīng)雙酶切后將FPS基因和DBR2基因分別連入表達(dá)載體上，獲得CaMV 35S-FPS-nos和CaMV 35S-DBR2-nos表達(dá)盒，通過無縫克隆技術(shù)將CaMV 35S-FPS-nos和CaMV35S-DBR2-nos表達(dá)盒連入另一表達(dá)載體中，獲得所述植物雙元表達(dá)載體；

3)將所述含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，采用凍融法將所述植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌；

4)將含F(xiàn)PS基因和DBR2基因的植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株，所述根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，包括外植體培養(yǎng)，所述根癌農(nóng)桿菌菌株與所述外植體的共培養(yǎng)，抗性再生植株的篩選，其中外植體培養(yǎng)中，當(dāng)青蒿無菌苗長至1.8-2.2cm時(shí)，剪取無菌苗葉片外植體；

5)對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因青蒿中的青蒿素含量進(jìn)行高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定，獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。

2.如權(quán)利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述FPS基因的序列如SEQ ID No.1所示，所述DBR2基因的序列如SEQ ID No.2所示。

3.如權(quán)利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述中間載體為pMD18T，所述表達(dá)載體為pCAMBIA1304，所述另一表達(dá)載體為pCAMBIA2300。

4.如權(quán)利要求1所述的提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定包括：色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為甲醇：水，其中，甲醇：水的體積比為60：40，柱溫30℃，流速1.0mL/min，進(jìn)樣量20μL，蒸發(fā)光散射檢測器漂移管溫度40℃，載氣壓力5bar。