[發(fā)明專利]一種通過愈傷組織共培養(yǎng)獲得斑錦臥牛植株的方法

在審

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• 申請日: 2016-11-11
• 公開（公告）號: CN107333649A
• 公開（公告）日: 2017-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王燕;陳劍平;汪一婷;呂永平;牟豪杰;李海營;陳志
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 杭州九洲專利事務(wù)所有限公司33101
• 代理人: 陳繼亮

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于組培方法領(lǐng)域，具體的說是一種通過愈傷組織共培養(yǎng)獲得斑錦臥牛植株的方法。

背景技術(shù)

斑錦多肉植物是植物的葉、莖等器官帶有不同于植株基本顏色的其他顏色的斑塊，這屬于植物的一種變異現(xiàn)象(徐民生，1991)。從植物發(fā)育學(xué)角度來講，斑錦多肉植物為嵌合體，一般是由同一株植物的少數(shù)細(xì)胞發(fā)生了變異后不斷的分裂并和正常細(xì)胞共存而形成的，例如常見到兜錦、玉扇錦等(巖鳴,2012)。相比原色來說，斑錦多肉植物主體顏色種類更多，觀賞價值更高，其市場價格可翻數(shù)倍。

然而，斑錦多肉植物的獲得方式主要依賴自然條件或人工繁殖中自發(fā)產(chǎn)生的變異，人工誘導(dǎo)研究較少。Binding等(1987)和Chen等(2006)通過原生質(zhì)體的共培養(yǎng)和細(xì)胞嫁接分別獲得了茄科和十字花科植物的種間嵌合體植株。可見，通過細(xì)胞及組織嫁接的人工誘導(dǎo)合成斑錦多肉植物具有一定的可行性。通過我們對多肉植物多年的組培研究發(fā)現(xiàn)，完全錦化的不定芽突變率較高，而斑錦不定芽則較少出現(xiàn)。因此，利用既有的自發(fā)產(chǎn)生的錦化臥牛植株的無菌材料來探索斑錦臥牛植株的人工合成方法對于斑錦多肉植物的種質(zhì)創(chuàng)新具有重要意義。但在此之前還沒有關(guān)于通過人工合成方法獲得斑錦臥牛植株的技術(shù)方法，更沒有成功的實例。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，而提供一種通過愈傷組織共培養(yǎng)獲得斑錦臥牛植株的方法。

本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案來完成的。該通過愈傷組織共培養(yǎng)獲得斑錦臥牛植株的方法主要包括如下步驟：

1)培養(yǎng)基的配制：

(1)基本培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，其中蔗糖20～30g/L，瓊脂6～9g/L，pH＝5.8；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 2～6mg/L+NAA 0～0.5mg/L；

(3)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA0～0.05mg/L；

(4)增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.1～0.3mg/L；

(5)壯苗培養(yǎng)基：MS+NAA 0.05～0.2mg/L；

2)愈傷組織的誘導(dǎo)：選取正常綠色和完全錦化的臥牛無菌苗的葉片為外植體，將其分別切傷后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織；

3)愈傷組織的增殖：將步驟2)中誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)接至新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中在有光條件下進(jìn)行增殖；

4)愈傷組織的共培養(yǎng)：將步驟3)增殖獲得的正常譜系和錦化譜系的愈傷組織在無菌條件下分別切成碎塊后混合接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)；

5)不定芽的誘導(dǎo)：挑取步驟4)中呈黃綠色相間或相連的嵌合愈傷塊置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)；

6)斑錦不定芽的增殖：將步驟5)中分化出的斑錦類型再生不定芽轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上進(jìn)行叢生芽的增殖培養(yǎng)；

7)壯苗及移栽：將步驟6)中增殖的斑錦不定芽分割成單株后轉(zhuǎn)接至壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行壯苗。

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟1)中，所述的培養(yǎng)基包括基本培養(yǎng)基和組培各階段培養(yǎng)基的組分具體為：

(1)基本培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基，其中蔗糖30g/L，瓊脂8g/L，pH＝5.8；

(2)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MS+6-BA 5mg/L+NAA 0.2mg/L；

(3)分化培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.01mg/L；

(4)增殖培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.2mg/L；

(5)壯苗培養(yǎng)基：1/2MS+NAA 0.1mg/L；

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟2)中，愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件是23±2℃，黑暗；

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟3)中，愈傷組織的共培養(yǎng)是分別將正常譜系(綠色)和錦化譜系(黃色)的愈傷組織在無菌條件下切成大約0.2cm見方的碎塊，并將兩者混合接種至新鮮的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行共培養(yǎng)以誘導(dǎo)嵌合愈傷組織的產(chǎn)生；

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟4)中，不定芽的誘導(dǎo)是挑取兩譜系嵌合成功的、呈黃綠色相間或相連的愈傷塊置于分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽分化；

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟5)中，斑錦不定芽的增殖是將分化出的斑錦類型不定芽轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基上通過誘導(dǎo)叢生芽進(jìn)一步增殖；

進(jìn)一步地，本發(fā)明在所述步驟3)、4)、5)、6)、7)中，培養(yǎng)條件是溫度為23±2℃、光照強(qiáng)度為30～80μmol·m^-2·s^-1、光照時間為8～12小時/天。