[發明專利]一種黃素單加氧酶突變體及其制備方法

在審

• 申請號: 201610992431.X
• 申請日: 2016-11-09
• 公開（公告）號: CN107384880A
• 公開（公告）日: 2017-11-24
• 發明（設計）人: 路福平;劉逸寒;賈雷博
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/81;C12N1/19;C12P13/04;C12R1/84
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙)11617
• 代理人: 栗華楠

技術領域：

本發明屬于生物工程領域，具體涉及一種黃素單加氧酶突變體及其制備方法。

技術背景：

蒜氨酸(Alliin，S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，S-allyl cysteine sulphoxide，SACS)是一種無味無臭的半水合物。蒜氨酸主要存在于大蒜鱗莖的細胞中，是大蒜中含量最多的含硫化合物，占大蒜中所有含硫化合物的85％以上，其含量高達0.5％-1.4％，最高達到3.2％(以干基計算)。

近些年來，西方醫藥生物研究人員對蒜氨酸的藥理作用做了大量研究。經研究發現，蒜氨酸主要有以下幾方面作用:廣譜抗菌作用。蒜氨酸對金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、白色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌、宋氏痢疾桿菌、傷寒桿菌及大腸桿菌等病源微生物均有不同程度的抑制和殺滅作用。在預防和治療人、畜及水產動物等腸道疾病方面效果顯著。能夠降低血液中的膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白。抑制血小板聚集，預防和治療高血脂癥和血栓形成及抗動脈粥樣硬化。具有抑制腫瘤的作用。蒜氨酸能在胃里增強巨噬細胞的功能，抑制硝酸鹽還原菌的生長繁殖，從而使胃腸道內亞硝酸鹽的含量減少，防止胃癌及直腸癌的發生。具有抗氧化作用。蒜氨酸還可以抑制脂質過氧化，具有抗氧化和清除自由基的活性，因此在減緩人體衰老等與自由基生成有關的方面發揮重要的作用。還可作為天然防腐劑。其對各種真菌的殺滅作用強度與化學防腐劑苯甲酸、山梨酸相近似。其它作用。還可用于治療鐮刀細胞貧血癥；提高并維持肝臟整體的功能；用于治療各種心血管疾病，如降血壓、降低眼壓等。此外蒜氨酸在抗衰老、降血脂、提高人體免疫力等方面也有很好效果。而隨著研究的深入，新發現的藥理作用更加復雜。目前蒜氨酸類保健產品在國外主要用于預防心肌梗死、腦梗死和降血脂等用途。

蒜氨酸既有如此重要的作用，然而，蒜氨酸的生產方法目前主要有化學合成法和組織培養法。化學合成法因為有化學污染、成本較高，因此難以在食品、醫藥生產中推廣應用。組織培養法是1986年佐野孝之輔用大蒜組織培養，得到蒜氨酸等有機硫化物，此法制備的蒜氨酸僅僅處于研究階段，且大蒜中存在蒜氨酸酶，使得蒜氨酸在分離提取中成本和難度都較高。而酶法催化，通過大蒜來源的黃素單加氧酶將脫氧蒜氨酸(S-烯丙基-L-半胱氨酸，S-Allyl-L-(+)-Cysteine,SAC)中硫元素氧化形成蒜氨酸(Alliin，S-烯丙基-L-半胱氨酸亞砜，S-allyl cysteine sulphoxide，SACS)的方法，具有酶催化效率高，反應條件溫和，特異性好等優點。且酶法催化反應用于工業生產時，可以簡化工藝流程、降低能耗、節省資源，減少污染。具有很好的利用價值及應用前景。

黃素單加氧酶(Flavin-containing monooxygenase,FMO)，是一組依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(Flavin Adenine Dinucleotide,FAD)、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和分子氧的微粒體酶，是重要的肝內藥物和化學異物代謝酶，可催化含氮、硫、磷、硒和其他親核雜原子的化合物和藥物的氧化。黃素單加氧酶能夠特異性催化半胱氨酸軛合物脫氧蒜氨酸(S-Allyl-L-(+)-Cysteine,SAC)中硫元素的氧化。因此，選擇以大蒜來源的黃素單加氧酶來催化SAC合成SACS具有很高的利用價值。

酶分子體外定向進化屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略。利用分子生物學手段在分子水平創造出分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突變體。它不需事先了解蛋白質的空間結構、活性位點、催化機制等因素，而是人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外改造酶基因，獲得具有某些預期特征的結構酶。其中，易錯PCR是指在擴增目的基因的同時，利用Taq酶不具備3’→5’校對功能，同時改變反應體系中Mn2+、Mg2+和各種dNTP的濃度，以一定的頻率向目的基因隨機引入堿基錯配，導致目的基因發生隨機突變。然而，經一次突變的基因一般很難獲得滿意的結果，由此又發展出連續易錯PCR(Sequential Error-prone PCR)策略。即將一次PCR擴增得到的產物作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行易錯，使每一次獲得的小突變不斷進行積累而產生重要的有益突變。因此，具有獨有的優勢。