[發明專利]一種用于丙肝病毒分型和耐藥位點檢測的探針和方法

有效

• 申請號: 201610929662.6
• 申請日: 2016-10-31
• 公開（公告）號: CN108018376B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 鐘宏彬;朱小龍;姚秋林;汪智蛟;陳俊清;劉娜
• 申請（專利權）人: 深圳華大因源醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C40B40/06
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 孫銀行;彭家恩

本發明公開了一種用于丙肝病毒分型和耐藥位點檢測的探針和方法。本發明的探針的核苷酸序列如SEQ ID NO：1?17所示。本發明提供的探針能夠用于丙肝病毒分型和耐藥位點檢測，并且可用于多種(總數量46種)HCV病毒亞型的分型以及耐藥位點檢測，可有效地篩選合適的藥物，避免使用已免疫的藥物，做到個性化治療。

技術領域

本發明涉及丙肝病毒檢測技術領域，尤其涉及一種用于丙肝病毒分型和耐藥位點檢測的探針和方法。

背景技術

丙肝病毒(HCV)是單股正鏈的RNA病毒，基因組全長約為9.6kb。HCV基因組由兩端兩個非編碼區(UTR)和中間的一個開放閱讀框(ORF)組成。ORF區又依次分為C區、E1區、E2區、NS1區、NS2區、NS區、NS4A區、NS4B區、NS5A區和NS5B區。由于HCV復制時所依賴的多聚酶缺乏校對功能，加上其本身為適應環境和逃避宿主的免疫監視作用而易發生突變，因此在長期的演化過程中逐漸形成了眾多突變株，即基因型。HCV基因型基分為6種基因型(1-6)，各基因型由分為a/b/c等各種亞型，目前已超過80種亞型。

不同基因型HCV引起的丙型肝炎病癥、病情程度判斷以及抗病毒藥物治療的使用等有明顯差別。目前認為HCV 1B型與重型肝炎和病情進行性發展有關，占總數的80％。在肝硬化失代償期、原發性肝癌和肝移植術后復發的患者中也以1b型多見。Amoroso等(1998)發現92％的1b型急性感染HCV患者會發展為慢性丙型肝炎，而其他基因型轉化概率則為35％-50％。姜樹朋等(2015年)研究發現不同基因型HCV感染與血液中HCV的病毒濃度相關，基因1型患者HCV濃度高于非1型患者；不同基因型HCV病患者需要使用不同抗病藥物，如Ⅲ型HCV感染者對IFN-α2b的完全應答率顯著高于Ⅱ型HCV感染者(P0.005)，而Ⅲ型HCV感染者對IFN-α2b的無應答率顯著低于Ⅱ型HCV感染者(P0.005)。Telaprevir與聚乙二醇干擾素(PEG－IFN)/ribavirin聯合用藥僅限于感染HCV基因1型的患者；2014年4月，歐洲肝病學會(EASL)在線發表了最新的《丙型肝炎治療指南》，對各種基因型HCV給出相應的治療方案，并指出啟動治療前，應評估HCV基因型和基因1亞型(1a/1b)，以確定治療方案的選擇。

HCV病毒復制時的高自然錯配率及RNA聚合酶保真性低的特點產生的位點突變，在使用藥物一段時間后，形成病毒耐藥性，引起病毒量反彈，限制了DAA臨床應用。HIV研究協會論壇(Forum for Collaborative HIV Research)在2012年報告了臨床相關的HCV突變位點以及耐藥性分析。而在2015年6月份該機構和藥品評價與研究中心(Center for DrugEvaluation and Research)等發布了一份更加詳細和更多的HCV DAA藥物治療相關耐藥位點報告，該報告羅列出了各基因型HCV NS3、NS5A、NS5B區域相關的突變位點，使用各種DAA藥物后產生的位點突變與野生型復制子倍數分析(fold-change)，以及各種DAA藥物對應的耐藥位點、HCV基因型以及耐藥性分析(fold-resistance)等。

HCV基因分型方法主要包括分子學方法(包括測序法、特異性引物PCR法、特異性探針雜交(LIPA)、基因芯片法、限制性片段長度多態性分析(RFLP)法等)、血清學方法(包括重組免疫印跡試驗(RIBA)和酶免疫試驗(EIA))。其中測序法通過PCR擴增有代表性的基因片段如5’NTR區、C區、NS5B區、再進行核苷酸序列測定，為HCV基因分型的“金標準”。這些方法能有效區分主要的基因型，但只有核苷酸的直接測序在區分亞型中是有效的。

現有HCV基因分型技術主要針對基因組中特定某個基因區域進行檢測分析，部分方法存在不穩定、準確性較低，且只能分型至基因型，而亞型分型能力則非常有限?，F有分型方法也基本上無法進行耐藥位點檢測。

發明內容