[發明專利]細菌基因編輯方法

有效

• 申請號: 201610919263.1
• 申請日: 2016-10-21
• 公開（公告）號: CN106609279B
• 公開（公告）日: 2020-08-14
• 發明（設計）人: 胡育誠;鍾沐恩;葉懿心;李泓
• 申請（專利權）人: 胡育誠;長春人造樹脂廠股份有限公司;長春石油化學股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/74
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 王芝艷;吳小瑛

本發明公開一種細菌基因編輯方法，其步驟包括：提供一菌體；將一pCas9質粒和一pKD46質粒送入菌體中；將一pCRISPR::LacZ質粒和一外源DNA共同送入含有pCas9及pKD46質粒的菌體中，以得到一培養菌液；以及將培養菌液涂布在一培養基上進行培養。借此，能增加細菌的基因編輯的速度，并提升細菌進行基因重組的成功率。

技術領域

本發明涉及一種細菌基因編輯方法，特別是涉及一種利用CRISPR/Cas9技術來增加大腸桿菌和藍綠菌的基因編輯效率以及基因重組成功率的細菌基因編輯方法。

背景技術

利用傳統的基因編輯技術來改造細菌以進行代謝工程時，需把所述細菌DNA的某些基因剔除或是同時放入好幾個基因，若將這些基因一次放入，片段會很大，因此須分好幾次把這些基因放進去，于過程中會加入抗生素、再篩選、接著把抗生素移除，重復這些步驟直到基因放入完全為止，其步驟繁雜又耗時。

CRISPR/Cas9為近年來備受矚目的基因編輯技術，相較于傳統基因編輯技術，CRISPR/Cas9因可以同時剔除或放入多個基因，增加了基因編輯的便利性，技術也相對簡單。然而，在過去的研究中，CRISPR/Cas9多用在哺乳動物的基因編輯，顯少應用在細菌中，即使有應用在細菌的研究結果，可以放入的DNA片段也較小，到3kb以上就有效率降低的現象。

因此，如何利用CRISPR/Cas9來提升在細菌中的基因編輯效率，以克服上述的缺失，已成為本領域所欲解決的重要課題之一。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種細菌基因編輯方法，用以將大片段的DNA放入菌體中，以增加細菌的基因編輯的速度，并提升細菌進行基因重組的成功率。

為了解決上述的技術問題，本發明所采用的一種技術方案是，提供一種細菌基因編輯方法，其步驟包括：提供一菌體；將一pCas9質粒和一pKD46質粒送入菌體中；將一pCRISPR::LacZ質粒和一外源DNA共同送入含有pCas9及pKD46質粒的菌體中，以得到一培養菌液；以及將培養菌液涂布在一培養基上進行培養。

優選地，將所述pCRISPR::LacZ質粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9及pKD46質粒的所述菌體中的步驟后，還包括：利用Cas9蛋白及可辨視LacZ基因的向導RNA在所述菌體中的一LacZ基因位置進行專一性地切割；以及將所述外源DNA插入所述菌體內具有專一性切割位置的所述LacZ基因中，以得到所述培養菌液。

優選地，所述菌體為大腸桿菌。

優選地，所述大腸桿菌為MG1655菌株。

優選地，所述pCRISPR::LacZ質粒為一可辨視LacZ基因的向導RNA。

優選地，將所述pCas9質粒和所述pKD46質粒送入所述菌體的方法為電穿孔轉型法。

優選地，將所述pCRISPR::LacZ質粒和所述外源DNA共同送入含有所述pCas9質粒及所述pKD46質粒的所述菌體中的方法為電穿孔轉型法。

優選地，所述培養基含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷、卡那霉素、以及四環霉素。

優選地，所述培養菌液的培養條件為，以37℃培養16至24小時。

為了解決上述的技術問題，本發明所采用的另一種技術方案是，提供一種提供一菌體；將一pHR_trc模板質粒和一pCas9-NSI質粒共同送入所述菌體中，以得到一培養菌液；以及將所述培養菌液涂布在一培養基上進行培養。

優選地，所述菌體為藍綠菌。

優選地，所述藍綠菌為細長聚球藻的S.elongatus PCC 7942菌株。