[發明專利]一種生產子囊霉素FK520的基因工程菌及其制備方法

有效

• 申請號: 201610905199.1
• 申請日: 2016-10-17
• 公開（公告）號: CN107955800B
• 公開（公告）日: 2021-05-28
• 發明（設計）人: 陳少欣;余志拓
• 申請（專利權）人: 上海醫藥工業研究院;中國醫藥工業研究總院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/76;C12N15/11;C12P17/18;C12R1/55
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;沈利

本發明公開了一種生產子囊霉素FK520的基因工程菌及其制備方法。該基因工程菌是在天然生產FK520的吸水鏈霉菌的基因組中整合有VGB基因的工程菌。通過發酵實驗驗證，利用該工程菌制備子囊霉素FK520，所得FK520的發酵單位較利用天然產FK520的吸水鏈霉菌發酵所得FK520的發酵單位提高了1.38倍。

技術領域

本發明屬于生物工程領域，特別涉及一種生產子囊霉素FK520的基因工程菌及其制備方法。

背景技術

子囊霉素FK520是含23元環的大環內酯類化合物，具有免疫抑制和抗真菌活性，其分子式為C₄₃H₆₇NO₁₂，分子量為789.99，易溶于甲醇、丙酮等。FK520是他克莫司(Tacrolimus,FK506)的乙基類似物，能夠抑制T細胞的活性及相關炎癥因子的合成，其衍生物“匹美莫司”，已成為一種重要的免疫抑制藥物。

目前，FK520主要還是通過吸水鏈霉菌(Streptomyces hygroscopicus)發酵的方法進行大規模生產，但是在實際的生產過程中，其發酵過程難以控制，菌體生長過快、過稠、過密，氧氣利用下降嚴重制約次生代謝產物FK520的積累。控制FK520發酵過程成為一個生產難題。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有的吸水鏈霉菌在發酵過程中氧氣受限的不足，提供一種能夠在FK520發酵過程中高效利用氧氣的吸水鏈霉菌及相應的基因、重組載體、轉化子和制備子囊霉素FK520的方法，可改善吸水鏈霉菌發酵過程的溶氧，促進菌體呼吸作用效果，提高所得FK520的發酵單位。

本發明解決上述技術問題的技術方案之一是：一種生產子囊霉素FK520的基因工程菌，其是天然生產FK520的吸水鏈霉菌的基因組中整合有血紅蛋白基因(Vitreoscillahemoglobin gene,VGB)的工程菌。其中，所述VGB基因可以是天然的外源VGB基因，也可以是針對天然產子囊霉素FK520的吸水鏈霉菌做過密碼子優化的VGB基因。較佳地，所述VGB基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本發明解決上述技術問題的技術方案之二是：一種VGB基因，其核苷酸序列如SEQID No.1所示。

本發明解決上述技術問題的技術方案之三是：一種VGB全序列基因，核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。該VGB全序列基因包括ermE*啟動子和VGB基因。

本發明解決上述技術問題的技術方案之四是：一種包含本發明所述VGB基因的重組載體。其中，所述重組載體的骨架為本領域常規的載體。較佳地，所述重組載體的骨架為質粒pSET-152。較佳地，所述質粒pSET-152的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。其可通過本領域常規的方法將本發明的VGB基因的核苷酸序列連接于載體。較佳地為，將雙酶切后獲得的具有粘性末端的目的VGB全序列基因片段插入到pSET-152載體的多克隆位點上，經連接酶連接，形成含有本發明的VGB基因的重組載體pSET-VGB。

本發明解決上述技術問題的技術方案之五是：一種包含本發明所述的重組載體的轉化子。其中，該轉化子的宿主細胞可以是本領域的常規宿主，優選大腸桿菌(Escherichiacoli)ET12567，將前述重組載體pSET-VGB轉化至大腸桿菌ET12567即可獲得轉化子。

本發明解決上述技術問題的技術方案之六是：一種制備所述生產子囊霉素FK520的基因工程菌的方法，包括將所述轉化子與天然產FK520的吸水鏈霉菌接合，挑選接合子即得。其中，所述天然產FK520的吸水鏈霉菌為常規的天然產FK520的吸水鏈霉菌，較佳地為吸水鏈霉菌ATCC 14891。所述的轉化子的宿主細胞可以是本領域的常規宿主，優選宿主為大腸桿菌ET12567(pUZ8002)。轉化子中含有的重組載體的骨架優選質粒pSET-152。