[發明專利]免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測魚蝦中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法

有效

• 申請號: 201610881818.8
• 申請日: 2016-10-09
• 公開（公告）號: CN107037139B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 李佩佩;張小軍;嚴忠雍;陳思
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋水產研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 33109 杭州杭誠專利事務所有限公司
• 代理人: 尉偉敏;趙越劍<國際申請>=<國際公布>

本發明公開了一種免疫親和柱凈化?超高效液相色譜?串聯質譜檢測魚蝦中3?甲基?喹噁啉?2?羧酸的方法，勻質好的樣品經2mol/L HCl溶液酸解后，將提取液pH調節至7～8，經過免疫親和柱富集和凈化后，采用LC?MS/MS測定，外標法定量。以0.1％甲酸水溶液?甲醇為流動相，梯度洗脫分離，電噴霧正離子多反應監測模式監測。本發明重現性好，靈敏度高，適合水產品中MQCA的實際測定。

技術領域

本發明涉及一種3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的檢測方法，特別涉及免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測魚蝦中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法。

背景技術

3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)是喹噁林類藥物喹乙醇的殘留標示物，同時也是喹烯酮、乙酰甲喹的代謝產物。研究表明喹乙醇對大多數動物有明顯的致畸作用，對人也有潛在致畸形，致突變，致癌作用。因此在世界范圍內都被禁止或限制用作飼料添加劑。喹乙醇在體內代謝迅速，而MQCA在體內滯留時間長，含量與總殘留關系穩定，是國際食品法典委員會認定的標示殘留物之一，可作為殘留分析監控的目標物質。

目前水產品中MQCA的檢測主要采用高效液相色譜法和高效液相色譜-串聯質譜法。液相色譜-串聯質譜以其定性準確、靈敏度高等特點被廣泛采用。為降低基質效應的影響，在前處理過程中，提取后的MQCA一般要再經過凈化濃縮步驟，固相萃取是MQCA最常用的凈化方式。根據MQCA的化學結構和性質，常采用HLB柱和陰離子交換柱凈化樣品。免疫親和柱(IAC)以抗原和抗體反應為基礎，具有特異性強、富集率高和凈化效能好的優勢，已成功應用于黃曲霉毒素、河豚毒素等物質的凈化和富集中，而目前未見采用免疫親和柱凈化水產品中的MQCA的文獻報道。

發明內容

本發明的目的在于提供一種免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測魚蝦中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，方法基質干擾低，特異性強，重現性、回收率均較好，操作簡便，適合于實際樣品的檢測。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：

一種免疫親和柱凈化-超高效液相色譜-串聯質譜檢測魚蝦中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的方法，包括以下步驟：

(1)樣品處理：稱取勻質好的樣品5g置于50mL具塞離心管中，加入10mL 2mol/LHCl溶液，渦旋振蕩1～2min后置于氣浴恒溫振蕩器中60℃恒溫酸解30min，冷卻至室溫后，8000r/min離心5min，移取上清液至50mL離心管中，殘渣中加入10mL 2mol/L HCl溶液重復提取一次，合并提取液并用水定容至25mL，混勻后用定量濾紙過濾，準確移取過濾后的提取液5mL用4.0mol/L NaOH溶液調pH至7～8，得樣品液；

(2)免疫親和柱凈化：取出免疫親和柱，待回至室溫后去掉免疫親和柱堵頭，放出柱內保存液，上樣品液，以1滴/2s的速度過免疫親和柱，上樣結束后,先后用4mL PBS溶液和4mL水淋洗親和柱，擠干柱內殘留液，棄去以上全部流出液，用4mL 2％的乙酸-甲醇溶液洗脫目標物，洗脫液于50℃水浴氮氣吹干，加入1mL初始流動相溶解殘渣得凈化液；

(3)液相色譜-質譜分析：凈化液經0.22μm濾膜過濾后供液相色譜-串聯質譜儀測定獲得3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的峰面積，將峰面積代入標準曲線分析計算，從而獲得樣品中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸的含量。

作為優選，步驟(2)中初始流動相為0.1％甲酸-甲醇溶液，0.1％甲酸溶液：甲醇溶液的體積比＝9:1。

作為優選，步驟(3)中色譜條件為：色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱，規格：50mm×2.1mm，1.7μm；進樣量10μL；樣品室溫度10℃，柱溫40℃；流動相：A為0.1％甲酸溶液，B為甲醇，梯度洗脫程序如下：0～3min,90％～10％A；3～4min,10％～90％A；4～5min，A保持90％不變；流速：0.3mL/min。